Biul. Wydz. Farm. WUM, 2013, 3, 18-26

http://biuletynfarmacji.wum.edu.pl/

Wersja pdf do pobrania

 

BIOTECHNOLOGIA GRZYBÓW. ZASTOSOWANIE W FARMACJI I SUPLEMENTACJI

Jadwiga Turło

Katedra i Zakład Technologii Leków i Biotechnologii Farmaceutycznej

Warszawski Uniwersytet Medyczny

ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa

tel. +4822 5720647, e-mail: jadwiga.turlo@wum.edu.pl 

Otrzymany 5.10.2012, zaakceptowany 6.02.2013, zamieszczony 8.05.2013

 

Otwórz bibliografię w osobnej ramce

 

STRESZCZENIE

Liczne gatunki grzybów należących do klasy Basidiomycetes posiadają zdolność biosyntezy biologicznie aktywnych związków, w tym o działaniu przeciwnowotworowym. Związki te izolowane są z owocników, grzybni, kultur mycelialnych i podłoży hodowlanych. Lentinula edodes (Berk.) Pegl., jest jednym z najszerzej wykorzystywanych grzybów leczniczych. Jest on źródłem dwóch zarejestrowanych w niektórych krajach leków. Obydwa preparaty wykazują działanie immunomodulacyjne i są stosowane w terapii nowotworów. L. edodes biosyntezuje również związki o działaniu m. in. przeciwbakteryjnym, przeciwwirusowym, obniżającym poziom cholesterolu, przeciwzakrzepowym. Izolowane z podłoża hodowlanego L. edodes rozpuszczalne w wodzie ligniny są testowane jako potencjalne leki w terapii hepatitis B i AIDS. Białka L. edodes składają się z 18 aminokwasów, w tym wszystkich egzogennych, występujących w proporcjach najbardziej wskazanych dla człowieka. Owocniki tego gatunku zawierają znaczne ilości witamin C, B1, B2, PP, B12 i D. Izolowane z L. edodes polisacharydy o działaniu immunomodulacyjnym są stosowane w chemoprewencji i wspomagająco w terapii nowotworów, wraz z chemoterapią, łagodząc jej efekty niepożądane. Ten niezwykle ciekawy grzyb jest również wykorzystywany do otrzymywania suplementów diety.

SŁOWA KLUCZOWE: Lentinula edodes, kultury mycelialne, selen, immunomodulacja, suplementy diety

 

ABSTRACT

FUNGAL BIOTECHNOLOGY. APPLICATIONS IN PHARMACY AND SUPPLEMENTATION

Many Basidiomycetes mushrooms have the ability to synthesize bioactive compounds, including anticancer agents that can be isolated from fruit bodies, mycelial cultures, or culture media. Lentinula edodes (Berk.) Pegl. is one of the most widely used medicinal mushrooms. This mushroom is the source of two drugs approved in several countries. Both drugs are immunomodulators and are used in cancer therapy. In addition, L. edodes forms compounds with antibacterial, antiviral, cholesterol lowering, and anticoagulant activities. Water-soluble lignans derived from L. edodes culture medium are being tested as potential drugs for the treatment of hepatitis B and AIDS. L. edodes protein is made up of 18 amino acids, including all essential amino acids, in ratios appropriate for humans. The fruit bodies of the mushroom contain considerable amounts of vitamins C, B1, B2, PP, B12 and D. Immunomodulatory polysaccharides isolated from L. edodes are being used in chemoprevention and as adjuvants in cancer treatment because of their ability to alleviate undesirable side effects of such therapies. This valuable mushroom is also used to produce dietary supplements.

KEYWORDS: Lentinula edodes, mycelial cultures, selenium, immunomodulation, dietary supplements

 

 

1. Grzyby lecznicze

Wśród opisanych do chwili obecnej około 116 tysięcy gatunków grzybów, stanowiących aktualnie oddzielne królestwo (aczkolwiek niektórzy autorzy podają liczbę równą 45, 72, 80 czy 105 tysięcy [1–3,9]), istnieje dość liczna grupa posiadająca zdolność biosyntezy związków o silnym działaniu farmakologicznym. Grzyby wytwarzające związki o najsilniejszym i najciekawszym, co do kierunku, działaniu należą do podkrólestwa Dikarya, do typu Ascomycota (workowce), klasy Ascomycetes (workowce właściwe) lub do typu Basidiomycota (grzyby podstawkowe), klasy Basidiomycetes (podstawczaki).

Bardzo ważnymi dla biotechnologii farmaceutycznej, a ściślej mówiąc dla przemysłu farmaceutycznego, przedstawicielami pierwszej z wymienionych klas (Ascomycetes) są tzw. grzyby strzępkowe. Przedstawiciele rodzajów Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus czy Fusidium są producentami antybiotyków, witamin, enzymów czy kwasów organicznych (cytrynowego, itakonowego, fusarowego czy glukonowego). Można uznać, że znaczenie grzybów klasy Ascomycetes w biotechnologii farmaceutycznej jest w pełni doceniane. Przyczyna jest prosta: antybiotyki ciągle jeszcze stanowią w służbie zdrowia około 1/3 rynku produktów biotechnologicznych, a grzyby strzępkowe, obok promieniowców, są najlepszymi producentami antybiotyków.

Inaczej ma się sprawa z grzybami klasy Basidiomycetes – ich potencjalne znaczenie w lecznictwie jest doceniane w krajach azjatyckich, ze względu na liczącą kilka tysięcy lat tradycję stosowania preparatów pochodzenia grzybowego w terapii różnych chorób. Kultura Zachodu odnosi się jednak do grzybów, jako do surowca leczniczego, ze sporą dozą nieufności.

Do klasy Basidiomycetes należą między innymi tzw. grzyby wyższe. Stanowią one około 10% wszystkich gatunków grzybów. Około 700 spośród nich biosyntezuje metabolity o działaniu farmakologicznym, bardzo często (651 gatunków) przeciwnowotworowym i immunostymulującym. To właśnie dla tych grzybów zarezerwowane jest określenie „grzyby lecznicze”, będące tłumaczeniem używanego w piśmiennictwie anglojęzycznym określenia „medicinal mushroom”. Wśród mykologów, fitochemików i – coraz częściej – biotechnologów  jest dość liczna grupa zajmująca się badaniami naukowymi tych organizmów. Od dziesięciu lat istnieje wydawane przez wydawnictwo Begell House czasopismo naukowe o międzynarodowym zasięgu, zajmujące się wyłącznie grzybami leczniczymi – International Journal of Medicinal Mushroom. Do najważniejszych spośród aktualnie znanych i opisanych grzybów leczniczych należy około 30 gatunków. Biosyntezują one związki o działaniu przeciwnowotworowym, immunomodulacyjnym, przeciwwirusowym (w tym przeciw HIV), przeciwbakteryjnym, przeciwzapalnym, przeciwgrzybicznym, przeciwcukrzycowym, hepatoprotekcyjnym, nerwotonicznym, obniżającym ciśnienie krwi oraz poziom cholesterolu i triglicerydów we krwi.

Zestawienie najważniejszych gatunków grzybów leczniczych wraz z ich działaniem farmakologicznym przedstawia Tabela 1, cytowana według Wasser i Weiss [4]. Z cytowanej poniżej tabeli wynika, że do gatunków najcenniejszych z punktu widzenia zarówno aktywności farmakologicznej jak i jej wykorzystania w istniejących już preparatach należą: Lentinula edodes, Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Schizophyllum communae, Hericium erinaceus i Grifola frondosa.

Istnieją cztery preparaty (zarejestrowane w niektórych krajach jako leki) stosowane w terapii nowotworów, izolowane z owocników lub grzybni grzybów klasy Basidiomycetes:

- Lentinan – frakcja polisacharydowa izolowana z Lentinula edodes;

- Schizofylan (SPG, sonifilan, sizofilan)frakcja polisacharydowa izolowana z Schizophyllum commune;

- Grifolanfrakcja polisacharydowa izolowana z Grifola frondosa;

- Krestin (PSK - polisacharyd i PSP - kompleks wielocukier-białko) izolowany z Trametes versicolor.

Dość powszechnie stosowane są w wielu krajach (w większości krajów azjatyckich, USA, Nowej Zelandii, Australii czy wreszcie, coraz częściej, w Europie) preparaty złożone o działaniu immunostymulacyjnym, będące ekstraktami z owocników i grzybni grzybów leczniczych. Rynek tych preparatów był pod koniec lat dziewięćdziesiątych dwudziestego wieku oceniany przez FDA na około 6,5 miliardów dolarów – i od tej pory stale rośnie [5].

Trwające od kilkunastu lat badania fitochemiczne grzybów leczniczych dopro­wadziły do identyfikacji wielu związków chemicznych odpowiedzialnych za poszczególne kierunki działania farmakologicznego. Badania tego typu prowadzone są w dalszym ciągu bardzo intensywnie, głównie w Japonii, Korei Południowej i innych krajach azjatyckich, Stanach Zjednoczonych Ameryki, Rosji i krajach europejskich, o czym świadczy wysoka liczba publikacji naukowych dotyczących tej tematyki ukazujących się corocznie. Podobnie jak w przypadku leku roślinnego, często preparaty złożone uzyskiwane z grzybów wykazują większą aktywność farma­kologiczną od czystych, izolowanych substancji.

Jako obiekt swoich badań wybrałam gatunek grzyba leczniczego o bardzo cennych właściwościach zarówno leczniczych jak i dietetycznych – Lentinula edodes (Berk.) Pegler.

 

2. Charakterystyka gatunku Lentinula edodes

Lentinula edodes (Berk.) Pegler jest grzybem saprofitycznym, żyjącym w naturalnych warunkach na drewnie martwych drzew liściastych z rodziny Fagaceae, wykorzystującym je jako źródło cukrów, hemicelulozy, celulozy i ligniny. Tworzy on owocniki o średnicy około 3-20 cm o barwie od jasnobrązowej do ciemnoczerwono-brunatnej. Pochodzi ze wschodniej Azji. Pierwotnym obszarem występowania tego gatunku jest japońska wyspa Amami [6]. L. edodes występuje naturalnie na terenie Japonii, Chin, Korei, częściowo państw Półwyspu Indochińskiego i Indii. Gatunek ten po raz pierwszy został opisany przez angielskiego botanika M. J. Berkeley w 1878 roku jako Agaricus edodes. Lentinula edodes posiada wiele nazw synonimicznych, pośród których są: Cortinellus shiitake P. Henn., C. berkeleyanus Ito et Imai, C. edodes (Berk.) S. Ito et Imai, Lentinus tonkinensis Pat., oraz najczęściej spotykana Lentinus edodes (Berk.) Singer.  Przynależność taksonomiczna tego gatunku w różnych okresach ulegała zmianie. Grzyb ten umieszczano w rodzajach: Armillaria, Collybia, Cortinellus, Lepiota, Pleurotus, Tricholoma, oraz w różnych rodzinach rzędu Agaricales [7,8].

W roku 1976 Pegler dokonał kolejnej rewizji taksonomicznej tego gatunku [6].

Według systematyki grzybów, którą opracowali Kirk i wsp. (2001) Lentinula edodes zalicza się do rodziny twardzioszkowatych – Marasmiaceae, do rzędu Agaricales – pieczarkowców [9]. W roku 2007 Hibbett i współpracownicy [10] dokonali kolejnej rewizji w systematyce grzybów i zaliczyli typy Basidiomycota i Ascomycota do podkrólestwa Dikarya, co aktualnie zamyka listę zmian w systematyce gatunku L. edodes:

Królestwo: Fungi (grzyby)

Podkrólestwo: Dikarya

Typ: Basidiomycota (grzyby podstawkowe)

Klasa: Basidiomycetes (podstawczaki)

Podklasa: Agaricomycetidae

Rząd: Agaricales (pieczarkowce)

Rodzina: Marasmiaceae (twardzioszkowate)

Rodzaj: Lentinula

Gatunek: Lentinula edodes (syn. Lentinus edodes) twardziak jadalny.

Lentinula edodes jest też znany pod japońską nazwą zwyczajową „shiitake”. Termin shiitake lub shii-take pochodzi od „shii” lub „shiia” – japońskiej nazwy rodzajowej drzewa Quercus cuspidata (Passania cuspidata), na którym grzyb ten występuje w warunkach naturalnych, oraz „take”, co po japońsku oznacza grzyb. W Chinach występuje pod kilkoma nazwami: xianggu - shiang-ku („fragrant mushroom” – grzyb aromatyczny), dōnggū („winter mushroom” – grzyb zimowy), huāgū („flower mushroom”). Polska nazwa gatunkowa to twardziak jadalny. W obrębie gatunku L. edodes istnieją 63 rasy geograficzne i szereg szczepów hodowlanych [6].

Pierwsze wzmianki o hodowli twardziaka jadalnego pochodzą z Chin z czasów panowania dynastii Song (960-1127) [11]. Nieco później umiejętność uprawy grzyba shiitake przejęli Japończycy. Ponadto od wielu wieków uprawia się shiitake także w Korei i na Tajwanie.  Obecnie gatunek ten jest hodowany na skalę produkcyjną w krajach Dalekiego Wschodu, gdzie głównym jego producentem jest Japonia. Wprowadzenie intensywnych metod uprawy twardziaka japońskiego pozwoliło rozszerzyć uprawę grzyba poza jego naturalną strefę klimatyczną i rozpowszechnić go w Stanach Zjednoczonych Ameryki i Europie. Obecnie twardziak zajmuje obok pieczarek czołowe miejsce wśród około 30 gatunków grzybów uprawianych na świecie w celach przemysłowych. Produkcję tego grzyba szacuje się na ponad 200 000 ton świeżej masy owocników rocznie [12, 13].

 

Tabela 1. Grzyby lecznicze należące do klasy Basidiomycetes i ich działanie farmakologiczne (wg. Wasser i Weis, 1999) [1].

X - działanie zbadane, wykorzystywane w lekach lub suplementach diety

+ - działanie znane, dotychczas brak wykorzystania

 

 

2.1. Skład chemiczny i wartości odżywcze Lentinula edodes

Cytowane w tym rozdziale dane dotyczą owocników L. edodes. Skład chemiczny biomasy grzybni hodowanej metodami biotechnologicznymi może w znaczący sposób różnić się od składu owocników i – podobnie jak skład owocników – jest zależny od składu podłoża hodowlanego i warunków hodowli.

Świeże owocniki twardziaka japońskiego zawierają 88 – 92% wody. Zawartość wybranych składników w suchej masie grzyba przedstawia Tabela 2.

 

Skład aminokwasowy L. edodes

W ocenie różnych badaczy zawartość białka w owocnikach L. edodes waha się w granicach 18,2 – 23,9% [15] lub 13,4 – 17,5% s.m. [16]. W części opracowań oceniano liczbę aminokwasów wchodzących w ich skład na 17 [17]. Według późniejszych doniesień liczba ta została oceniona na 20 [13]. Różnica w ocenie wynikała z metodyki oznaczeń. Wysoka zawartość aminokwasów przy stosunkowo małym u-

dziale azotu ogólnego (2,9 – 4,4%) [14] oznacza, że owocniki L. edodes zawierają najmniej związków azotowych nie wchodzących w skład białek spośród wszystkich dotychczas zbadanych grzybów. Obecność tego typu substancji (np. chityny) jest przyczyną niezbyt wysokiej strawności owocników, mimo wysokiej zawartości białka. Wyliczony wskaźnik wartości odżywczej na podstawie zawartości aminokwasów, plasuje twardziaka zaraz za produktami mięsnymi, zaś przed produktami mlecznymi [11]. W skład owocników L. edodes wchodzą wszystkie egzogenne aminokwasy. Zawartość niezbędnych aminokwasów w ich całkowitej ilości wynosi 39%. W porównaniu z innymi gatunkami grzybów L. edodes charakteryzuje się wysoką zawartością leucyny i fenyloalaniny, przy niskiej zawartości lizyny [14].

 

Węglowodany

Ogólna zawartość węglowodanów w suchej masie owocników twardziaka jadalnego wynosi 67,5 – 78%, z czego 15,87% przypada na cukry proste [11]. Analiza chromatograficzna składu monosacharydowego hydrolizatów L. edodes wykazała obecność cukrów prostych: glukozy, mannozy, galaktozy, ksylozy, rybozy, fukozy i ramnozy. W ekstraktach z owocników twardziaka wykryto także dwucukry – sacharozę i maltozę, oraz trisacharyd rafinozę. Wysoki procent cukrów stanowią polisacharydy, w tym (1-3)-b-D-glukany, które odpowiadają między innymi za lecznicze właściwości grzyba. W owocnikach i grzybni L. edodes, w strukturze ściany komórkowej i wewnątrzkomórkowo występują zarówno rozpuszczalne w wodzie a‑ i b‑ glukany, galaktany, mannany, ksyloglukany, jak i nierozpuszczalne heteroglikany, poliuronidy i b‑glukany [10,11].

 

Lipidy

Zawartość lipidów w owocnikach twardziaka jadalnego waha się w granicach 4,8 – 8,0%. W ich skład wchodzą kwasy tłuszczowe, mono-, di- oraz triglicerydy, fosfolipidy i sterole. Aż 78% przypada na tłuszcze zawierające w swojej strukturze nienasycone kwasy tłuszczowe. Największy udział w składzie tłuszczów ma kwas linolenowy (18:2) – około 68%, kwas olejowy (18:1) 5,5%, zaś z nasyconych – kwas palmitynowy (16%) [18].

 

Witaminy

Owocniki L. edodes są dobrym źródłem witamin, głównie z grupy witamin B (B1, B2, B12). Szczególnie wysoka jest w nich zawartość niacyny, kwasu foliowego oraz ryboflawiny (witamina B2), której ilość jest większa niż w warzywach. Według Furlani i Godoy [19] zawartość witaminy B1 w L. edodes jest porównywalna z zawartością w ziarnach zbóż i podobna do obecnej w owocach, natomiast większa niż w jajach. Zawierają także witaminę C. Dostępność biolo­giczna folianów z biomasy L. edodes jest porównywalna do ich przyswajalności z warzyw. Bardzo zadowalający wydaje się być także fakt, że Lentinula edodes zawiera witaminę B12 która, jak sądzono do niedawna, może być biosyntezowana wyłącznie przez bakterie. Jest to szczególnie ważne dla osób stosujących dietę wegetariańską [20].

Grzyby, obok zwierząt, są jedynymi organizmami posiadającymi zdolność biosyntezy witaminy D2 (ergokalciferolu) [21]. Grzyby hodowane przy dostępie światła słonecznego zawierają więcej tej witaminy, gdyż przejście ergosterolu, charakterystycznego dla grzybów sterolu, składnika między innymi ściany komórkowej, w ergokalciferol wymaga indukcji promieniowaniem ultrafioletowym [22]. Ergosterol spotykany jest w komórkach grzybów w stanie wolnym, w postaci nadtlenków, estrów z wyższymi kwasami tłuszczowymi, glikozydów lub kompleksów z polisacharydami. Owocniki L. edodes zawierają 6,79 mg ergosterolu w 1 g suchej masy, co stanowi 83 – 89% całkowitej zawartości steroli. [23].

 

Tabela 2. Skład chemiczny owocników L. edodes (wg Chang i Miles, 2004) [14].

Składnik

Zawartość (% suchej masy)

Białko

13,4 17,5

Węglowodany

67,5 78,0

Włókno

7,3 8,0

Popiół

3,7 7,0

 

kcal/100 g s.m.

Wartość kaloryczna

387 – 392

 

Tabela 3. Zawartość witamin w 100 g owocników Lentinula edodes

(według Matilla i wsp.) [17].

Witamina

Zawartość w świeżym owocniku

Zawartość w suchej masie

Witamina B1 [mg]

0,05

26

Witamina B2 [mg]

0,15

1,8

Kwas foliowy [μg]

25

300

Niacyna [mg]

2,6

31

Witamina B12 [μg]

0,07

0,8

Witamina C [mg]

2,1

25

Witamina D [μg]

0,1

1

Sucha masa [%]

8,4

 

 

Mikroelementy

Lentinula edodes, podobnie jak inne grzyby, ma dużą zdolność do kumulowania różnych pierwiastków. Ich zawartość w grzybie jest zależna od składu podłoża hodowlanego. W porównaniu z innymi grzybami twardziak jadalny charakteryzuje się bardzo dużą zawartością wapnia, oraz w znaczących ilościach zawiera potas, magnez, sód, cynk i fosfor [14,19]. Warto również zwrócić uwagę na charakterystyczny dla L. edodes, niespotykany w żywności stosunek molowy potasu do sodu, rzędu 70–90:1 [24].

 

Tabela 4. Zawartość wybranych składników mineralnych w suszu Lentinula edodes

według Siwulski i Reguła [25], oraz * Mattila i wsp. [17].

Składniki mineralne

 

Zawartość [mg/kg suchej masy]

Potas

31 551 ± 303

Magnez

1 622 ± 5,09

Sód

135,6 ± 1,66

Wapń

157,7 ± 0,17

Cynk

125,9 ± 13,0

Żelazo

39,5 ± 0,45

Miedź

13,7 ± 0,74

Selen

0,039*

 

Substancjami nadającymi charakterystyczny zapach i smak owocnikom L. edodes są cykliczne sulfidy, z których największe znaczenie ma 1,2,3,5,6­pentatiepan czyli lentionina [26. Ponadto w shiitake występują 1,2,4-tritiolan, 1,2,4,6-tetratiepan.

 

2.2. Właściwości lecznicze Lentinula edodes

Tradycja wykorzystania grzyba shiitake (L. edodes) w celach leczniczych w krajach Dalekiego Wschodu (Chiny, Japonia, Korea) liczy parę tysięcy lat. Pierwsze wzmianki na ten temat pochodzą z roku 119. Znacznie później, w czasie panowania dynastii Ming, lekarz Wu Juei napisał, że grzyb shiitake może być wykorzystywany jako lek na choroby wątroby, układu krążenia, układu oddechowego i zmęczenie. Przypisywano shiitake też właściwość wzmagania sił życiowych i hamowania procesu starzenia [27].

W okresie ostatnich trzydziestu lat L. edodes stał się jednym z najdokładniej zbadanych gatunków grzybów leczniczych. Wyodrębniono z owocników i grzybni szereg związków, którym można przypisać działanie farmakologiczne, głównie immunomodulacyjne i przeciwnowotworowe. Szczególne znaczenie w lecznictwie mają frakcje polisacharydowe (lentinan) i ekstrakty z grzybni i podłoża hodowlanego (LEM, LAP, KS-2), które względu na swoje właściwości stanowią surowiec do otrzymywania preparatów leczniczych [28,29]. Obecnie zarejestrowane są one na terenie krajów azjatyckich oraz Stanów Zjednoczonych.

Z preparatów złożonych uzyskiwanych z grzybni L. edodes szczególnie istotne są dwa:

LEM – wyciąg wodny otrzymany z grzybni shiitake hodowanej na podłożach stałych. Skład ekstraktu jest złożony. Zawiera on aminokwasy, witaminy, polisacharydy o różnej strukturze, glikoproteiny, polifenole, ergosterol. Do substancji czynnych tego wyciągu należą też rozpuszczalne w wodzie ligniny [26,30].

LAP – nierozpuszczalna w alkoholu frakcja, uzyskiwana przez wytrącanie z wodnego wyciągu (LEM) etanolem w stosunku objętościowym 4:1 (etanol/woda). Ekstrakt ten zawiera wiele różnorodnych składników m. in. lentioninę i frakcje polisacharydowe o różnej budowie.

Obydwa preparaty, LEM i LAP, stosowane zarówno doustnie, jak i w postaci iniekcji wykazują silne działanie przeciwnowotworowe, immunomodulujące jak np. indukcja interferonu i hamowanie zakażalności i efektu cytopatologicznego wirusa HIV, blokują uwolnienie wirusa Herpes simplex typu I z tkanek; mają także właściwości bakteriobójcze [26–31].

Zidentyfikowane do chwili obecnej biologicznie czynne związki zawarte w owocnikach i grzybni gatunku Lentinula edodes to:

Lentinan – rozgałęziony b-D-glukan o masie 400 – 800 kDa  – immunomodulator, indukuje odpowiedź immunologiczną ustroju. Stosowany jako lek przeciwnowotworowy.

Lentinan został wyizolowany w 1970 r. przez G. Chiharę i współpracowników na drodze frakcjonowania rozpuszczalnych w wodzie polisacharydów, pochodzących ze ściany komórkowej owocników L. edodes [32,33]. Podstawową strukturę polisacharydu stanowi łańcuch b-(1-3)-D-glukanu z dwoma bocznymi rozgałęzieniami, występującymi co 5 jednostek cukrowych, połączonymi z łańcuchem głównym wiązaniami b-(1-6)-glikozydowymi (Ryc. 1) [34].

 

Ryc. 1. Budowa liniowa b-glukanów, lentinan (wg. Borchers i wsp. [35]).

 

Niezwykle istotną rolę w działaniu biologicznym wielocukrów, w tym lentinanu, odgrywa struktura przestrzenna. Sześć wielocukrów otrzymanych z grzybów, stosowanych w leczeniu nowotworów: schizofylan, lentinan, skleroglukan, kurdlan, cynerean i b-(1-3)-D-ksylan przyjmuje w roztworze konformację helikalną (Ryc. 2). Konformacja ta odgrywa rolę w działaniu przeciwnowotworowym [36].

 

Ryc. 2. Helikalna struktura (1-3)-b-D-glukanów (wg. Bluhm i Sarko [37]).

 

Działanie przeciwnowotworowe lentinanu związane jest z aktywnością immunomodulacyjną. Ze względu na mechanizm działania lentinan zaliczany jest do grupy BRM (biological response modifiers) – związków pochodzenia naturalnego oddziałujących na odpowiedź immunologiczną organizmu. Lentinan wiążąc się prawdopodobnie z receptorami CR-1 i CR-3 komórek gospodarza, aktywuje makrofagi, komórki NK oraz wzmaga odpowiedź zależną od limfocytów T [38]. Prowadzi to do wzrostu stężenia interleukin (IL-1, IL-2), TNF-a, IGF-g, które odpowiadają między innymi za hamowanie proliferacji komórek nowo­tworowych oraz apoptozę (Ryc. 3) [10,39]. W Japonii lentinan jest od lat 80-tych XX wieku stosowany jako lek parenteralny w terapii nowotworów, głównie w terapii skojarzonej z chemioterapią, radioterapią oraz po chirurgicznym usunięciu guza. W przeprowadzonych w Japonii badaniach prospektywnych zaobserwowano prawie dwukrotne wydłużenie czasu przeżycia oraz poprawę jakości życia w przypadku stosowania terapii skojarzonej, w porównaniu z efektami leczenia pacjentów, u których stosowano wyłącznie cisplatynę i tegafur [40,41].

Lentinan stosowany jest w leczeniu nowotworów piersi, płuc, jelita grubego. Wykazuje także działanie przeciwwirusowe, między innymi działa na wirusa HIV. W skojarzeniu z azydotymidyną (AZT) lentinan hamuje ekspresję antygenu p24 w większym stopniu niż sama azydotymidyna. Prowadzone w Stanach Zjednoczonych Ameryki badania kliniczne II fazy w których lentinan podawany był wraz z didanozyną wskazały natomiast jego wpływ na poziom limfocytów CD4 [43]. Korzystny efekt lentinanu w terapii AIDS jest też związany z jego właściwościami immunomodulacyjnymi [44]. Lentinan, podobnie jak inne izolowane z L. edodes frakcje polisacharydowe, zwiększa również wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciwko WZW B [10].

Ryc. 3. Prawdopodobny mechanizm działania lentinanu (wg Chihara i wsp.[42]).

 

KS-2 – jest działającym przeciwnowotworowo mannopeptydem o masie cząsteczkowej 60–95 kDa, złożonym głównie z łańcuchów a-D-mannozy i niewielkiej ilości peptydów zawierających serynę, treoninę, alaninę, prolinę i śladowe ilości innych aminokwasów. Został wyizolowany z ekstraktów podłoża hodowlanego hodowli mycelialnej L. edodes, przez wytrącanie metanolem [45].  Stymuluje wydzielanie interferonu i aktywuje makrofagi, jednak mechanizm działania przeciwnowotworowego KS-2 nie jest całkowicie wyjaśniony [46]. Wyodrębniono frakcje KS-2-A (wzmacnia funkcje obronne organizmu), KS-2B i KS-2D (zwiększają wydzielanie interferonu).

LE – kompleks polisacharydowo-białkowy wyizolowany z grzybni L. edodes. Jest to b-(1-3)-D-glukan z łańcuchami bocznymi b-(1-6)-D-glukozy. W części peptydowej LE występują aminokwasy jak Asp, Glu, Ala i inne. W badaniach zauważono, że LE zwiększa ekspresję genów dla IL-2 i TNF-a, co może sugerować mechanizm indukcji odpowiedzi immunologicznej Th [47].

L-II a-(1-3)-D-glukan o masie 203 kDa wyizolowany z owocników L. edodes – immunomodulator, wykazuje działanie antyoksydacyjne. Związek ten powoduje stymulację odpowiedzi komórek T, zwiększa wytwarzanie TNF-a, IFN-g ale nie wpływa na IL-2. L-II wpływa także na wytwarzanie NO, zwiększa aktywność katalazy w makrofagach (działanie antyoksydacyjne. Mechanizm ten wskazuje na możliwość zastosowania L-II w leczeniu nowotworów. W badaniach prowadzonych na zwierzętach potwierdzono także, że L-II wpływa na zwiększenie masy śledziony i grasicy [48].

JLS-18 – (rozpuszczalna w wodzie lignina) – blokuje namnażanie wirusa Herpes simplex, hamuje replikację HIV in vitro, jest aktywatorem makrofagów [49]. JLS i JLS-18 są to wodne ekstrakty z grzybni L. edodes. JLS-18 zawiera 65 – 75% lignin, 15 – 30% polisacharydów i 10 – 20% białek [50].

Lentin – białko o masie 27,5 kDa. Jest to proteina wyizolowana w 2003 roku z owocników L. edodes przez Ngai i Ng [51]. Swoją budową przypomina inne odkryte wcześniej białka o właściwościach przeciwgrzybiczych. Związek ten charakteryzuje się właściwościami przeciwgrzybiczymi, przeciwbakteryjnymi, hamuje odwrotną transkryptazę HIV-1. Hamuje także proliferację komórek białaczki [52].

Lentionina – egzobiopolimer o masie 10 kDa, zawiera siarkę – działa przeciwbakteryjnie i przeciwgrzybiczo. Wykryta została w owocnikach a także w hodowli komórkowej. Związek ten posiada w swojej budowie siarkę, ma właściwości przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze. Silniejszą aktywnością odznacza się pochodna lentioniny – bis-[(metylosulfonylo)metylo]disiarczek – która działa na bakterie Staphylococcus aureus, Bacillus subtilisEscherichia coli [49].

Lentinozyna – związek purynowy – działa antybiotycznie.

Eritadenina (lentinacin) – kwas 2(R),3(R)-dihydroksy-4-(9-adanylo)masłowy (Ryc. 4)  – obniża ciśnienie krwi i poziom triglicerydów oraz wolnego cholesterolu w surowicy krwi. Charakteryzuje się małą toksycznością, przy dobrej efektywności, pomimo, że wchłanialność eritadeniny wynosi zaledwie 10%. Początkowo przypuszczano, że mechanizm działania eritadeniny polega na hamowaniu biosyntezy cholesterolu, jednakże badania na szczurach przeprowadzone przez Sugiyama i wsp. nie potwierdziły tej hipotezy [50]. Zauważono natomiast, że podawanie eritadeniny szczurom wpływa na fosfolipidy wątrobowe i powoduje obniżenie stosunku fosfatydylocholiny do fosfatydyloetanoloaminy. Może to sugerować, że eritadenina obniża poziom cholesterolu oddziałując na metabolizm fosfolipidów wątrobowych [53] przyspieszając wydalanie oraz rozkład cholesterolu [44,50].

Glikoproteina, (EBP) – egzobiopolimer o masie 52 kDa – działa przeciwcukrzycowo. Związek ten według doniesienia Yang i współpracowników (2002) obniża stężenie glukozy we krwi oraz podwyższa poziom insuliny [54].

 

Ryc. 4. D-eritadenina.

 

Frakcje polisacharydowe – wykazują działanie ochronne na wątrobę, zwiększają wytwarzanie przeciwciał przeciwko WZW, wykazują też działanie antyoksydacyjne [10].

Lentinamycyna A i B – związki o działaniu przeciwbakteryjnym, pochodne poliacetylenowe [10].

Polifenole – podobnie jak inne gatunki grzybów, Lentinula edodes zawiera związki o działaniu antyoksydacyjnym [55]. Wyróżnia się tu związki będące polifenolami. Obecność w grzybie tokoferoli oraz b-karotenu może wzmacniać właściwości przeciwutleniające polifenoli i frakcji polisacharydowych [56, 57].

 

2.3. Zastosowanie w lecznictwie i suplementacji diety

Wiele preparatów otrzymywanych z L. edodes , zawierających opisywane w poprzednim rozdziale związki farmakologicznie czynne, jest aktualnie na etapie badań klinicznych. Dopuszczone w wielu krajach preparaty (nie dotyczy to na razie Polski) są głównie rejestrowane jako suplementy diety. Wyjątkowy jest przypadek lentinanu – licencyjnego preparatu japońskiej firmy Ajinomoto [58].

Jak wspomniane zostało w poprzednim rozdziale, lentinan, stosowany w niektórych krajach w terapii nowotworów, jest wysoko oczyszczoną frakcją polisacharydową – rozgałęzionym b-D-glukanem. Lentinan jest podawany w iniekcjach – raz lub dwukrotnie w tygodniu, najczęściej równocześnie z chemioterapią. Stosowany jest głównie w przypadkach raka przewodu pokarmowego (żołądka, jelita grubego), płuca i piersi. Dawka optymalna wynosi 1 mg, w iniekcji dożylnej lub domięśniowej [59]. Wyższe dawki (np. 10 mg) mogą wpływać depresyjnie na układ odpornościowy [10]. Najlepsze rezultaty notowano, gdy lentinan podawany był przed rozpoczęciem chemio- lub radioterapii, lub po zabiegu operacyjnym. Notowano również znaczące przedłużenie życia w przypadku pacjentów z nieoperacyjnymi, zaawansowanymi nowotworami [60]. Inne zastosowania lentinanu (w terapii HIV czy WZW-B) są testowane klinicznie. Zasadniczą wadą lentinanu jest jego stosunkowo wysoka cena. Jest uzasadniona złożoną procedurą izolacji lentinanu i jej niską wydajnością. Według Chihary 31 gramów lentinanu jest izolowane z 200 kg świeżych owocników L. edodes [30]. Inne preparaty, w tym opisywane w poprzednim rozdziale ekstrakty z grzybni i podłoża hodowlanego L. edodes (LEM, LAP) są suplementami diety. Mają postać tabletek powlekanych, kapsułek, koncentratów, sproszkowanych ekstraktów czy syropów. Wiele z nich jest standaryzowanych i przebadanych klinicznie. Ich główny kierunek działania to stymulacja układu odpornościowego, działanie przeciwnowotworowe i chemoprewencyjne. Zalecane są również w chorobach infekcyjnych, nadciśnieniu, hipercholesterolemii i hiperlipidemii, co jest uzasadnione zawartością opisywanych w poprzednim rozdziale związków czynnych. Zawierają też wspomniane w rozdziale 2.1. składniki odżywcze. W przypadku ekstraktów z grzyba i grzybni (LEM), w zależności od jednostki chorobowej, są stosowane dawki rzędu 0,5–6 g/dzień [57]. Dla preparatów otrzymywanych ze sproszkowanych owocników shiitake dawka dzienna wynosi 6–16 g, co odpowiada 90 g świeżych owocników [10].

 

3. Biotechnologia grzybów wyższych – stan obecny i perspektywy

W 1966 roku Gregory opublikował wyniki poszukiwań substancji o działaniu przeciwnowotworowym w owocnikach ponad 200 gatunków grzybów należących do klasy Basidiomycetes. Aktywnych farmakologicznie substancji poszukiwał też w około 7000 pohodowlanych pożywkach płynnych, stosowanych do fermentacji wgłębnej różnych gatunków grzybów [61]. Testy działania przeciwnowotworowego dla izolowanych substancji były przeprowadzone na trzech modelach gryzoni i ujawniły, że wielocukry izolowane z owocników 22 gatunków grzybów i 50 pożywek pohodowlanych wykazują hamujący wpływ na komórki guza, włączając takie rodzaje nowotworów jak mięsak S-180, gruczolak 755 i białaczka L-1210.

Badania Gregory’ego można uznać za pierwsze próby stosowania hodowli wgłębnych grzybów wyższych do pozyskiwania substancji farmakologicznie czynnych. Współcześnie coraz częściej mycelia lub podłoża pohodowlane, pochodzące z hodowli wgłębnej grzybni grzybów wyższych są wykorzystywane do otrzymywania biologicznie czynnych substancji [62–64].

Powodów zainteresowania biotechnologicznymi metodami hodowli grzybów leczniczych jest kilka:

- Ogromną zaletą jest krótki czas hodowli czystych kultur mycelialnych w fermentorach, zarówno na podłożach płynnych jak i stałych. W porównaniu z czasem hodowli owocników grzybów daje to ogromne skrócenie czasu uzyskiwania porównywalnej biomasy.

- Hodowle mycelialne w bioreaktorach mogą być prowadzone w wysoce powtarzalnych warunkach, co skutkuje stałym składem hodowanej biomasy. Ułatwia to standaryzację preparatów leczniczych uzyskiwanych z grzybów.

- Optymalizacja składu podłoży hodowlanych i warunków fizykochemicznych hodowli umożliwia regulację metabolizmu hodowanej grzybni. W efekcie umożliwia to znaczne podwyższenie wydajności biosyntezy związków biologicznie czynnych (np. metabolitów wtórnych).

- Możliwa jest kontrola i zachowanie biochemicznej i genetycznej identyczności hodowanej w fermentorze grzybni.

Istnieją też poważne trudności ze stosowaniem tego typu metod:

- Nie wszystkie gatunki grzybów wyższych mają zdolność efektywnego wzrostu w postaci kultur mycelialnych w bioreaktorze.

- W przypadku niektórych gatunków grzybów istnieją znaczące różnice w składzie chemicznym owocników grzyba i mycelium hodowanego metodami biotechnologicznymi. Nie zawsze różnice te są korzystne w przypadku stosowania hodowli mycelialnych do otrzymywania farmakologicznie czynnych związków.

- Szlaki metaboliczne biosyntezy wielu farmakologicznie czynnych substancji przez grzyby wyższe są ciągle jeszcze – w porównaniu z roślinami, czy nawet drożdżami – słabo poznane i opisane. Znacząco utrudnia to projektowanie i optymalizację warunków procesu biotechnologicznego, dobór prekursorów biosyntezy czy promotorów wzrostu szczepu.

Niemniej coraz częściej producenci substancji leczniczych (Lentinan, LEM, Grifon, PSK, PSP) i suplementów diety pochodzenia grzybowego wprowadzają metody biotechnologiczne do produkcji [65]. Zgodnie ze zwyczajem stosowanym od dawna w biotechnologii farmaceutycznej (np. przez producentów antybiotyków), warunki procesu rzadko są opisywane w publikacjach, a czasami nie są nawet patentowane – co ułatwia zachowanie ich w tajemnicy. Ze względu na rozliczne zalety metod biotechnologicznych zapewne tylko kwestią czasu jest rozszerzenie tego typu metod na uzyskiwanie większości produktów leczniczych pochodzenia grzybowego czy roślinnego.

 

* Prezentowana praca stanowi fragment rozprawy habilitacyjnej pt „Kultury mycelialne Lentinula edodes (Berk.) Pegler  - optymalizacja biosyntezy biologicznie czynnych produktów, akumulacja biopierwiastków, perspektywy aplikacyjne”.

 

4. Stosowane skróty

ADCC

cytotoksyczność zależna od przeciwciał (Antibodies Dependent Cell Cytotoxicity)

APC

komórki reprezentujące antygen

AZT

azydotymidyna

BRM

związki pochodzenia naturalnego oddziałujące na odpowiedź immunologiczną organizmu (Biological Response Modifiers)

C3a, C3b

anafilatoksyny

NK

główna grupa komórek układu odpornościowego odpowiedzialna za zjawisko naturalnej cytotoksyczności (Natural Killer)

IL-1

interleukina 1 - zbiorcza nazwa, którą określa się cytokiny o kluczowym znaczeniu dla procesu zapalnego i szerokim spektrum działania

IL-2

interleukina 2 - cytokina będąca najważniejszym czynnikiem wzrostu dla limfocytów T, zwłaszcza cytotoksycznych, oraz komórek NK

Komórki K

jednojądrzaste komórki układu immunologicznego (Killer Cells)

Limfocyty Tc

limfocyty cytotoksyczne odpowiedzialne za niszczenie komórek zakażonych przez drobnoustroje oraz za niszczenie komórek nowotworowych

Limfocyty Th

subpopulacja limfocytów T

Limfocyty Treg

limfocyty T regulatorowe

TNF-a

czynnik martwicy guza, czynnik nekrozy nowotworów (Tumor Necrosis Factor)

 

5. Bibliografia

1.    Branco S. (2011). Fungal Diversity – An Overview, The Dynamical Processes of  Biodiversity - Case Studies of Evolution and Spatial Distribution, PhD. Oscar Grillo (Ed.), ISBN: 978-953-307-772-7, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/the-dynamical-processes-of-biodiversity-case-studies-of-evolutionand- spatial-distribution/fungal-diversity-an-overview

2.    Kirk P. M., Cannon P. F., Minter D. W., Stalpers J. A. (2008). Dictionary of the Fungi.   10th Edition. CABI Publishing. Wallingford, UK.

3.    Hawksworth D.L. Fungal diversity and its implications for genetic resource collections Studies in Mycology. 2004; 50: 9-18

4.    Wasser S. P., Weiss A. L. Medicinal Properties of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: Current Perspectives (Review). International Journal of Medicinal Mushroom. 1999; 1: 31-62

5.    http://vm.cfsan.fda.gov

6.    Brodziak Ł. Lentinus edodes (Berk.) Sing. – Shiitake – interesujący grzyb jadalny. Wiadomości Botaniczne. 1984; 28(3): 227-236 

7.    Woźniak W., Gapiński M., Pelowska A., Kossowska I. Jakość owocników shiitake w zależności od składu podłoża. Zeszyty Problemow Postępów Nauk Rolniczych. 1999; 466: 561-568

8.    Kopiński L. Niekonwencjonalna hodowla grzybni twardziaka jadalnego Lentinus edodes w stałym podłożu. Przemysł fermentacyjny i owocowo-warzywny. 1993; 1: 13-15 

9.    Kirk P. M., Cannon P. F., David J. C., Stalpers J. A.: Ainsworth’s and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 9th ed. CABI Publishing, New York, 2001 

10.  Hibbett D. S. A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycological Research. 2007; 111(5): 509-547

11.  Hobbs C. Medicinal Mushroom: An exploration of tradition, healing and culture. 2nd ed. Botanica Press Inc.: Santa Cruz Ca, USA, 1995

12.  Kalbarczyk J. Wpływ wybranych dodatków do podłoża na jakość owocników Lentinula edodes (Berg.) Sing. Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus. 2004; 3(2): 189-196

13.  Wasser S. P. Shiitake (Lentinus edodes). Encyclopedia of Dietary Supplements. Marcel Dekker, New York: 2005. pp 653-664

14.  Chang S. T., Miles P. G. Mushrooms. Cultivation, nutritional value, medicinal effect, and environmental impact. Boca Raton, Florida. CRC Press, 27-36, 2004

15.  Brodziak Ł., Majchrzak R. Badania wartości odżywczej twardziaka Lentinus edodes (Berk) Sing. – shiitake, na tle innych gatunków grzybów jadalnych, Roczniki PZH. 1984; T. XXXV, Nr 1

16.  Manzi P., Gambelli L., Marconi S., Vivanti V., Pizzoferrato L. Nutrients in edible mushrooms: an inter-species comparative study. Food Chemistry. 1999; 65: 477-482

17.  Siwulski M., Czerwińska-Nowak A., Sobieralski K. Biologia i uprawa twar­dziaka jadalnego – Shiitake. PWRiL Poznań 2007 pp. 9-10; 20-23; 200‑208

18.  Longvah T., Deosthale Y. G. Compositional and nutritional study on edible wild mushroom from northeast India. Food Chemistry. 1998; 63(3): 331-334

19.  Furlani R., Godoy H. Vitamins B1 and B2 contents in cultivated mushrooms. Food Chemistry. 2008; 106: 816-819

20.  Mattila P., Könkö K., Eurola M., Pihlava J., Astola J., Vahteristo L., Hieta­niemi V., Kumpulainen J., Valtonen M., Piironen V. Contents of Vitamins, Mineral Elements, and Some Phenolic Compounds In Cultivated Mushrooms. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2001; 49: 2343-2348

21.  Mattila P. H., Piironen V. I., Uusi Rauva E. J., Koivistoinen P. E., Vitamin D contents in edible mushrooms. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1994; 42: 2449-2453

22.  Mattila P., Suonpää K., Piironen V. Functional properties of edible mushrooms. Nutrition. 2000; 16: 694-696

23.  Mattila P., Lampi A‑M., Ronkainen R., Toivo J., Piironen V. Sterol and vitamin D2 contents in some wild and cultivated mushrooms. Food Chemistry. 2002; 76: 293-298

24.  Vetter J. Data on sodium content of common edible mushrooms, Food Chemistry. 2003; 81: 589-593

25.  Siwulski M., Reguła J. Dried shiitake (Lentinula edodes) and oyster (Pleurotus ostreatus) mushrooms as a good source of nutrient. Acta Scientiarum Polo­norum, Technologia Alimentaria. 2007; 6(4): 135-142

26.  Morita K., Kobayashi S. Isolation, structure and synthesis of lenthionine and its analogs. Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1967; 15: 988-993

27.  Hobbs Ch., Medicinal Mushroom: An exploration of tradition, healing and culture. 2nd Ed. Botanica Press Inc.: Santa Cruz, Ca, USA, 1995

28.  Wasser S. P., Weis A. L. Medicinal Mushrooms. Lentinus edodes (Berk.) Singer. Nevo E., Ed.; Peledfus Publ. House: Haifa, Israel, 1997

29.  Mizuno T. Shiitake, Lentinus edodes: functional properties for medicinal and food purposes. Food Reviews International. 1995; 11: 7-21

30.  Mizuno T. A development of antitumor polysaccharides from mushroom fungi. Food and Food Ingredients Journal of Japan. 1996; 167: 69-85

31.  Pegler D. The genus Lentinula (Tricholomataceae tribe Collybiaeae). Sydowia – an International Journal of Mycology. 1983; 36: 227-239

32.  Chihara G., Maeda Y., Hamuro J., Sasaki T., Fukuoka F. Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes (Berk.) Sing. Nature. 1969; 222(5194): 687-688

33.  Chihara G., Hamuro J., Maeda Y., Arai Y., Fukuoka F. Fractionation and purification of the polysaccharides with marked antitumor activity, especially lentinan, from Lentinus edodes (Berk.) Sing. (an edible mushroom). Cancer Research. 1970; 30(11): 2776-81

34.  Sasaki T., Takasuka N., Further study of the structure of an anti-tumor poly­saccharide from L. edodes. Carbohydrate Research. 1976; 47(1): 99-104

35.  Borchers A. T., Keen C. L., Gershwin M. E. Mushrooms, Tumors, and Immunity: An update. Society for Experimental Biology and Medicine. 2004; 393-406

36.  Zhang L., Li X., Xu X., Zeng F. Correlation between activity, molecular weight, and conformation of Lentinan. Carbohydrate Research. 2005; 340(8): 1515-1521

37.  Bluhm T. L., Sarko A. The triple helical structure of lentinan, a linear β-(1-3)­‑D­‑glucan. Canadian Journal of Chemistry. 1976; 55: 293-299

38.  Zheng R., Jie S., Hanchuan D., Moucheng W. Characterization and immuno­modulating activities of polysaccharide from Lentinus edodes. International Immunopharmacology. 2005; 5(5): 811-820

39.  Yan J., Zong H., Shen A., Chen S., Yin X., Shen X., Liu W., Gu X., Gu J. The beta-(1→6)-branched beta-(1→3) glucohexaose and its analogues con­taining an alpha-(1→3)-linked bond have similar stimulatory effects on the mouse spleen as Lentinan. International Immunopharmacology. 2003; 3: 1861-1871

40.  Yoshino S., Tabata T., Hazama S., Iizuka N., Yamamoto K., Hirayama M., Tangoku A., Oka M. Immunoregulatory effects ofthe antitumor polysaccharide lentinan on Thl/Th2 balance inpatients with digestive cancers. Anticancer Research. 2000; 20: 4707-4711

41.  Nakano H., Namatame K., Nemoto H., Motohashi H., Nishiyama K., Kumada K. A multi-institutional prospective study of lentinan in advanced gastric cancer patients with unresectable and recurrent diseases: effect on prolongation of survival and improvement of quality of life. Hepatogastroenterology. 1999; 46(28): 2662-2668

42.  Chihara G., Hamuro J., Maeda Y. Y., Shiio T., Suga T., Takasuka N., Sasaki T. Antitumor and metastasis-inhibitory activities of lentinan as an immuno-modulator: an overview. Cancer Detectection and Prevention Supp. 1987. 1; 423-443

43.  Tochikura T. S. Inhibition (in vitro) of replication and of the cytopathic effect of human immunodeficiency virus by an extract of the culture medium of Lentinus  edodes mycelia. Medical Microbiology and Immunology. 1988; 777: 235-244

44.  Gordon M., Bihari B., Goosby E., Gorter R., Greco M., Guralnik M., Mimura T., Rudinicki V., Wong R., Kaneko Y. A placebo-controlled trial of the immune modulator, lentinan, in HIV-positive patients: a phase I/II trial. Journal of Medicine. 1998; 29(5-6):  305-330

45.  Fujii T., Maeda H., Suzuki K., Ishida N. Isolation and characterization of a new antitumor polysaccharide, KS-2, extracted from culture mycelia of Lentinus edodes .The Journal of Antibiotics. 1978; 31: 1079-1090

46.  Suzuki C. Killing activity of experimental tumor cells given to macrophage by new antitumor immunopotentiator, KS-2. Japanese Journal of Bacterio­logy. 1978; 33: 78-85

47.  Liu M., Li J., Kong F., Lin J., Gao Y. Induction of immunomodulating cytokines by a new polysaccharide-peptide complex from culture mycelia of Lentinus edodes. Immunopharmacology. 1998; 40: 187-198

48.  Zheng R., Jie S., Hanchuan D., Moucheng W. Characterization and immuno­modulating activities of polysaccharide from Lentinus edodes. International Immunopharmacology. 2005;  5(5): 811-820

49.  Sarkar S., Koga J, Whitley R. J., Chatterjee S.  Antiviral effect of the extract of culture medium of Lentinus edodes mycelia on the replication of herpes simplex virus type 1. Antiviral Research. 1993; 20: 293-303

50.  Hanafusa T. Intestinal absorption and tissue distribution of immunoactive and antiviral water-soluble [14C] lignins in rats. Yakubutsu Dotai (Xenobiotic Metabolism and. Disposition). 1990; 5: 409-436

51.  Ngai P. H. K., Ng T. B. Lentin, a novel and potent antifungal protein from shitake mushroom with inhibitory effects on activity of human immuno­deficiency virus-1 reverse transcriptase andproliferation of leukemia cells. Life Sciences. 2003; 73: 3363-3374

52.  Hatvani N. Antibacterial effect of the culture fluid of Lentinus edodes mycelium grown in submerged liquid culture. Antimicrobial Agents. 2001, 17: 71-74.

53.  Sugiyama K., Akachi T., Yamakawa A. Eritadenine-induced alteration of hepatic phospholipid metabolism in relation to its hypocholesterolemic action in rats. Nutritional Biochemistry. 1995; 6:80-87

54.  Yang B. K., Kim D. H., Jeong S. C., Das S., Choi Y. S., Shin J. S., Lee S. C., Song C. H. Hypoglycemic effect of a Lentinus edodes exo-polymer produced from a submerged mycelial culture. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 2002; 66(5): 937-42

55.  Cheung L. M., Cheung P. C. K., Ooi Y. E. C., Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts. Food Chemistry. 2003; 81(2): 249-255

56.  Yang J., Lin H., Mau J. Antioxidant properties of several commercial mushrooms. Food Chemistry. 2002; 77: 229-235

57.  Kitzberger C., Smania A., Pedrosa R. C., Ferreira S. R. S. Antioxidant and antimicrobial activities of shiitake (Lentinula edodes) extracts obtained by organic solvents and supercritical fluids. Journal of Food Engineering. 2007; 80: 631-638.

58.  Ajinomoto Company Information Publication, 1984. Lentinan: A new type of anticancer drug, Ajinomoto Co. Inc. 1-15, Kyobashi, Chuo-ku Tokyo, Japan.

59.  Aoki T. (1984). Lentinan. In: Immune Modulation Agents and Their Mechanisms. eds R. L. Fenichel and M. A. Chirgos, Marcel Dekker, New York. pp 63-77

60.  Hobbs C. Medicinal value of Lentinus edodes (Berk.) Sing. A literature review. International Journal of Medicinal Mushroom. 2000; 2: 287-302

61.  Gregory F. J., Studies on antitumor substances produced by Basidiomycetes. Mycologia. 1966;  58: 80-91

62.  Kim S. W., Hwang H. J., Park J. P., Cho Y. J., Song C. H., Yun J. W. Mycelial growth and exo-biopolymer production by submerged culture of various edible mushrooms under different media. Letters in Applied Microbiology. 2002; 34; 56-61

63.  Kim S. W., Hwang H. J., Na Y. S., Song S. K., Yun J. W. Influence of nutritional conditions and exopolisaccharide production in Paecilomyces sinclarii. Letters in Applied Microbiology. 2002;  34: 389-393

64.  Shih, I-L., Chou, B-W., Chen, C-C, Wu, J-Y., Hsich, C. Study of mycelial growth and bioactive polysaccharide production in bath and fed-bath culture of Grifola frondosa. Bioresource Technology. 2008; 99: 785-793

65.  http://www.icnet.uk/labs/med_mush/final_pdfs/chapt9.pdf