BIULETYN

 Wydziału Farmaceutycznego

 Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego

 

 Biul. Wydz. Farm. WUM, 2010, 1, 1-12

http://biuletynfarmacji.wum.edu.pl/


Wersja pdf do pobrania

ZASTOSOWANIE METOD OBLICZENIOWYCH DO WYZNACZANIA BUDOWY

MODELI FARMAKOFOROWYCH RECEPTORÓW 5-HT1A, 5-HT2A ORAZ 5-HT7

Anna Bielenica*, Jerzy Kossakowski

Katedra i Zakład Chemii Medycznej, I Wydział Lekarski,

Warszawski Uniwersytet Medyczny, ul. Oczki 3, 02 007 Warszawa

*autorka korespondująca, tel./faks: +22 628 0679; e-mail: anna.bielenica@wum.edu.pl

Otrzymany 29.12.2009; zaakceptowany 28.01.2010; zamieszczony 23.03.2010

 

Otwórz bibliografię w osobnej ramce

 

STRESZCZENIE

Prezentowana praca zawiera przegląd modeli farmakoforowych receptorów serotoninowych 5-HT1A, 5-HT2A oraz 5-HT7, opisanych w czasie ostatniej dekady. Przedstawiono modele ligandów receptora 5-HT1A i 5-HT2A  wyznaczone metodami analizy konformacyjnej i trójwymiarowej analizy QSAR. Hipotezę oddziaływań ligand-receptor 5HT7 uzupełniono o modele skonstruowane na podstawie struktury receptora. Opisy farmakoforów zostały poparte przykładami znanych aktywnych ligandów i grup związków wykorzystanych do wytworzenia modeli.

SŁOWA KLUCZOWE: modele farmakoforowe, ligandy arylopiperazynylowe, receptor 5-HT1A, receptor 5-HT2A, receptor 5-HT7

 

ABSTRACT

COMPUTATIONAL METHODS IN DETERMINATION OF PHARMACOPHORE MODELS OF 5-HT1A, 5-HT2A AND 5-HT7 RECEPTORS.

The objective of this article is an overview of existing pharmacophore models for 5-HT1A, 5-HT2A and 5-HT7 receptors, which have been described during the last decade.  Models of 5-HT1A and 5-HT2A  receptors, developed by conformational analysis and 3D QSAR methods are presented. Hypotheses of the ligand-5-HT7 receptor interaction were complemented by models constructed on the basis of the receptor’s structure. Various pharmacophore concepts are characterized by structures of known active ligands and sets of compounds used for the generation of models.

KEYWORDS: pharmacophore models, 5-HT1A receptor, 5-HT2A receptor, 5-HT7  receptor

 

 

1. Wprowadzenie

Poszukiwanie nowych środków leczniczych jest jednym z największych wyzwań dla przemysłu farmaceutycznego. Wprowadzenie nowego leku na rynek trwa obecnie 7-12 lat, a koszty tego procesu szacuje się na około 1,2 mld dolarów [1]. 5 z 40 000 związków przetestowanych na zwierzętach dochodzi do etapu badań klinicznych na ludziach, i tylko jeden z nich zostaje składnikiem nowego leku [1]. Zastosowanie komputerowo wspomaganych metod projektowania leków, czyli projektowanie in silico, umożliwia znaczne obniżenie nakładów pieniężnych i skrócenie czasu trwania procesu.

Wprawdzie modelowanie molekularne obecnie nie pozwala na dokładne określenie aktywności biologicznej badanych związków, ale umożliwia wybór potencjalnych ligandów spośród znanych struktur oraz ich optymalizację pod kątem oddziaływania z receptorem. Techniki komputerowe znacznie zwiększają przewidywalność w zakresie toksyczności, reaktywności i właściwości fizykochemicznych badanego związku, minimalizując nakłady na badania na zwierzętach i syntezę chemiczną [2,3]. Jedynie najbardziej obiecujące pochodne syntetyzuje się i poddaje się badaniom biologicznym.

Metodyka obliczeniowego projektowania leków obejmuje przeszukiwanie elektronicznych baz danych strukturalnych, dokowanie ligandów, projektowanie ligandu de novo, korzystanie z programów obliczających parametry geometryczne cząsteczek, modelowanie ilościowej zależności między strukturą związku a jego aktywnością oraz ostateczne wyznaczanie modelu farmakoforowego [4,5]. Wyznaczenie modelu polega na określeniu podstawowych elementów strukturalnych, niezbędnych do rozpoznania ligandu przez receptor i utworzenia stabilnego kompleksu aktywnego [6].

Przy topograficznym modelowaniu receptorów zakłada się, że ligandy łączą się z receptorem zawsze w ten sam sposób, przy czym konformacja ligandu pozostaje niezmieniona. Wiadomo jednak, że przyłączenie ligandu wywołuje zmiany konformacyjne białka receptorowego [7].

Niniejszy przegląd literaturowy ma na celu przybliżenie znanych modeli farmakoforowych receptorów serotoninowych 5-HT1A, 5-HT2A i 5-HT7.

 

2. Metody komputerowo wspomaganego projektowania leków

Zależnie od danych, którymi dysponuje się przystępując do projektowania leków, wyróżnić można dwa podstawowe sposoby postępowania [8,9]:

Najkorzystniejszą sytuację stwarza znajomość zarówno grupy ligandów o zbadanej aktywności, jak i struktury przestrzennej danego receptora.

 

2.1. Generowanie modelu farmakoforowego

Według definicji IUPAC, farmakofor to zespół cech sterycznych i elektronowych koniecznych do osiągnięcia optymalnych oddziaływań supramolekularnych ze specyficzną strukturą biologiczną (receptorem), niezbędnych do wyzwolenia (lub zablokowania) jej biologicznej odpowiedzi. Farmakofor nie jest rzeczywistą cząsteczką i nie reprezentuje  rzeczywistego zbioru grup funkcyjnych, stanowi czysto abstrakcyjne pojęcie bazujące na oddziaływaniach, głównie niekowalencyjnych, między grupą związków a daną strukturą białkową [8,10].

Według innej definicji, pojęcie farmakofora odnosi się do przestrzennej orientacji różnych grup funkcyjnych lub właściwości związku, niezbędnych do wywołania lub zablokowania aktywności biologicznej [11]. Farmakofor zazwyczaj składa się z 3-4 elementów strukturalnych, takich jak pierścień aromatyczny, grupa hydroksylowa czy zasadowy atom azotu, rozmieszczonych względem siebie w ściśle określonych odległościach [5]. Klasyczny przykład definicji grupy farmakoforowej, wygenerowanej na podstawie znanych struktur różnych ligandów, przedstawiono na Ryc. 1.

Grupa farmakoforowa może być również określona jako największy wspólny mianownik dla grupy aktywnych cząsteczek, uwzględniający akceptory i donory wiązania wodorowego, oddziaływania hydrofobowe, pierścienie aromatyczne, grupy dodatnio i ujemnie naładowane. Oddziaływania te reprezentują cechy chemiczne komplementarne do trójwymiarowej struktury receptora [1,12].

Ryc. 1. Dwupunktowy model farmakoforowy receptora 5-HT1A według Hiberta i współpracowników (agonista: d = 5,37 Å, h = 0,2 Å; antagonista: d = 5,6 Å, h = 1,6 Å) [11,13].

 

Generowanie grupy farmakoforowej wymaga znajomości jak największej liczby aktywnych ligandów i/lub budowy receptora. Istnieje kilka metod budowania farmakofora. Jedna z nich opiera się na analizie budowy chemicznej 3 lub 4 aktywnych związków, zawierających różne chemiczne struktury wyjściowe [13]. Inna wykorzystuje około 15 związków o zróżnicowanej strukturze chemicznej oraz wartości ich IC50 lub Ki50, zawierające się w przedziale większym niż trzy rzędy wielkości. Ugrupowanie farmakoforowe może być również wygenerowane de novo, jeśli znana jest budowa miejsca wiązania ligandu w receptorze [1].

 

2.2. Analiza QSAR i QSPR

QSAR (ang. Quantitative Structure-Activity Relationship), czyli badania ilościowej zależności między strukturą związku a jego działaniem, opierają się na założeniu, że właściwości biologiczne leku są matematyczną funkcją jego parametrów fizykochemicznych (deskryptorów). Z kolei metody QSPR (ang. Quantitative Structure-Property Relationship) pozwalają na określenie jakościowej relacji między strukturą związku a jego właściwościami fizycznymi (momentem dipolowym, temperaturą wrzenia itp.). Obie metody służą do przewidywania toksyczności związku, przy czym QSAR odnosi się do biologicznej aktywności potencjalnej substancji leczniczej, natomiast QSPR do jej właściwości biofizyczno-chemicznych.

            W celu wyznaczenia zależności struktura - aktywność, wybiera się kilka spośród przyjętych deskryptorów, takich jak [14]:

·       strukturalne i topologiczne (liczba atomów, masa cząsteczkowa, liczba pierścieni aromatycznych, liczba atomów wodoru i heteroatomów, ilość grup funkcyjnych, parametry steryczne Tafta ES);

·       elektronowe (ładunek całkowity, moment dipolowy, polaryzowalność, energia orbitali molekularnych HOMO i LUMO, stałe Hammeta σ, współczynniki indukcyjne i rezonansowe);

·       geometryczne (objętość molekularna, moment bezwładności, pole powierzchni);

·       termodynamiczne (współczynnik podziału 1-oktanol : woda logP, rozpuszczalność w wodzie logS, hydrofobowość podstawników πX, refraktywność molowa MR).

            Podczas ustalania zależności aktywności związku od jego budowy pod uwagę bierze się pod uwagę najczęściej łatwo mierzalne parametry - hydrofobowość, właściwości elektronowe i steryczne [15,16]. Miarą hydrofobowości związku jest współczynnik podziału logP, który koreluje ze zdolnością do przenikania przez błony biologiczne. Ma on duże znaczenie w przypadku leków działających na ośrodkowy układ nerwowy, dla których istotnym parametrem jest zdolność do przechodzenia przez barierę krew-mózg. Z kolei współczynniki π opisują hydrofobowość poszczególnych grup funkcyjnych. Parametr steryczny Tafta opisuje właściwości i rozmiar otoczenia molekularnego, w którym znajduje się dany podstawnik. Stała Hammeta jest miarą wpływu podstawnika na gęstość elektronową w pierścieniu aromatycznym.

            Analiza QSAR nie bierze pod uwagę trójwymiarowej struktury cząsteczki ani jej chiralności. Jej głównym zadaniem jest wygenerowanie równania opisującego zależność aktywności biologicznej ligandów od wartości poszczególnych deskryptorów. Aktywność biologiczna związku może być przedstawiona w postaci Ki, IC50, ED50, EC50 lub Km [17]. Analiza Hanscha, najpopularniejsza empiryczna metoda QSAR, to metoda wielokrotnej regresji liniowej wyrażona przez liniową kombinację od 3 do 12 deskryptorów. Równanie Hanscha pozwala przewidzieć aktywność związku jeszcze niezbadanego pod kątem aktywności farmakologicznej. Pozwala to zaplanować syntezę związków o najbardziej pożądanych właściwościach [12,14].

            Stosuje się wiele komputerowo wspomaganych metod QSAR. Jedną z nich jest geometria odległości, która pozwala na wyszukanie farmakofora dla receptora o nieznanej budowie, jeśli znana jest mała grupa związków biologicznie czynnych. Natomiast inna metoda, stosowana przez Hopfingera, zwana analizą kształtu cząsteczkowego, umożliwia wyznaczenie aktywnych konformacji potencjalnego związku czynnego farmakologicznie oraz jego molekularnego kształtu podczas wiązania z receptorem [14].

 

2.3. Analiza CoMFA i CoMSIA

CoMFA (ang. Comparative Molecular Field Analysis) oraz CoMSIA (ang. Comparative Molecular Similarity Index Analysis) to metody trójwymiarowej analizy QSAR (3D QSAR). Podstawą analizy CoMFA jest założenie, że aktywność biologiczna związku jest funkcją ogólnego kształtu i wielkości cząsteczki oraz jej właściwości elektronowych [15]. CoMSIA jest rozszerzeniem metodologii CoMFA i pozwala na porównywanie struktur molekularnych związków o podobnych właściwościach, co umożliwia znalezienie ogólnych cech cząsteczki istotnych dla wiązania z receptorem [17,18].

W metodzie CoMFA do obliczenia pól sterycznych i elektrostatycznych wokół cząsteczki korzysta się z potencjałów Coulomba i Lennarda-Jonesa, natomiast analiza CoMSIA wykorzystuje do tych obliczeń funkcję Gaussa, podając dodatkowo wielkości pól hydrofobowych i wodorowych [19,20]. Obliczone wartości poszczególnych pól siłowych traktuje się następnie jako niezależne, choć silnie skorelowane ze sobą deskryptory.

Wynik analizy CoMFA można przedstawić w postaci kolorowej mapy konturowej otaczającej cząsteczkę, co pozwala na wizualną identyfikację obszarów odpowiedzialnych za uprzywilejowane i nieuprzywilejowane wiązania z receptorem [19,21]. Metoda wymaga, aby wszystkie analizowane związki były rozpatrywane w takich pozycjach i orientacjach, jakie przyjmują w miejscu wiążącym receptora. Osiąga się to poprzez dopasowanie każdej z nich do wspólnego farmakoforu [22].

 

3. Ligandy receptora 5-HT1A

N-podstawione pochodne alkilo-1-arylopiperazyn stanowią jedną z najważniejszych klas ligandów receptora 5-HT1A [23,24,25,26]. W ostatnich latach ukazało się wiele prac poświęconych aktywności farmakologicznej tej grupy związków. Intensywne badania zależności struktura-aktywność dowodzą, że aktywność jest wynikiem obecności grupy arylowej przy atomie N1 pierścienia piperazyny oraz łańcucha alkilowego [27,28,29] alkoksylowego [30,31], alkenylowego [32,33] lub układu cykloheksylowego przy N4 [34,35,36,37]. Niektórzy autorzy podkreślają również rolę końcowego hydrofobowego ugrupowania cyklicznego w stabilizacji kompleksu ligand-receptor poprzez oddziaływania π-π oraz dipolowe [23,37,38,39]. Inne prace dowodzą natomiast, że ta część cząsteczki nie wpływa znacząco na powinowactwo i selektywność [40].

W Tabeli 1 przedstawiono przykładowe ligandy receptora 5-HT1A, w tym analogi znanych leków przeciwdepresyjnych i przeciwlękowych, takich jak buspiron czy tandospiron, o strukturze giętkiej (związki I-VII) lub ograniczonej swobodzie konformacyjnej (VIII-IX).

 

Tabela 1. Ligandy receptora 5-HT1A z grupy policyklicznych arylopiperazyn

Związek

 

Wzór strukturalny

Ki [nM]

Bibliografia

I

(Buspiron)

16

 

26

II

(Tandospiron)

25

 

26

III

(Arypiprazol)

4,2

41

IV

0,4

42

V

0,48

26

VI

40

 

26

VII

13,4

43

VIII

5,0

32

IX

8,0

32

 

 

3.1. Modele farmakoforowe wyznaczone metodami analizy konformacyjnej

Receptor 5-HT1A jest obecnie najlepiej poznany spośród receptorów serotoninowych z grupy 5-HT1, ze względu na swoje kliniczne znaczenie w leczeniu stanów lękowych i depresji [44,45]. Opracowano wiele modeli farmakoforowych tego receptora.

Pierwszy model zaproponowała grupa Hiberta, stosując graficzną metodę przybliżenia aktywnego analogu AAA (ang. Active Analog Approach) oraz procedurę dopasowania MultiFit, które opierały się na analizie konformacji ligandów należących do różnych klas związków chemicznych. W ten sposób powstał model dwupunktowy, bazujący na ogólnych cechach strukturalnych aktywnych ligandów z tej grupy, charakteryzujących się występowaniem pierścienia aromatycznego i zasadowego atomu azotu [46]. Buspiron, którego część pirymidynylopiperazynowa może przyjmować rożne konformacje, posłużył do opisania modelu zarówno dla agonisty, jak i antagonisty. Tłumaczy to, dlaczego w obrębie grupy arylopiperazyn znaleźć można ligandy wykazujące cechy agonistyczne, częściowo agonistyczne oraz antagonistyczne. Model Hiberta jest najbardziej uniwersalnym modelem farmakoforowym receptora 5-HT1A, wspólnym dla wszystkich klas ligandów.

Rozszerzony model receptora 5-HT1A opracował Mokrosz wraz ze współpracownikami, wprowadzając trzeci punkt: układ π-elektronowy [47]. Punkt ten odnosił się do alternatywnego sposobu nakładania o-podstawionych 1-arylopiperazyn, w którym wolna para elektronowa atomu azotu leży w płaszczyźnie pierścienia aromatycznego. W przypadku bardziej złożonych arylopiperazyn, ich duża giętkość pozwalała na uzyskanie takich konformacji, w których wszystkie trzy punkty farmakofora były zajęte i końcowy fragment amidowy osiągał pozycję odpowiadającą pierścieniowi π-elektronowemu (Ryc. 2).

W trójpunktowym modelu topograficznym zespołu Chilmonczyka [48] opracowanym dla analogów buspironu, układ π – elektronowy został zastąpiony imidową grupą karbonylową. Zdaniem autorów, zdolność ligandu do przyjęcia konformacji zgiętej odgrywa kluczową rolę w wiązaniu z receptorem 5-HT1A.

Ryc. 2. Konformacje arylopiperazyn: (A) ortogonalna; (B) planarna; (C) model farmakoforowy Mokrosza i współpracowników  (d1 = 4,3-6,6 Å, d2 = 5,0-5,4 Å; d3 = 7,1-9,1 Å, α = 98,6°; I, II – układy π–elektronowe) [47].

 

Zastosowanie metod symulacyjnych dynamiki molekularnej w ustalaniu modelu farmokoforowego przedstawił zespół Bronowskiej, wykorzystując analizę konformacyjną analogów buspironu [49]. Związki strukturalnie zgodne z przyjętym farmakoforem posiadały silnie zgięty łańcuch n-butylowy, przy czym pierścień piperazyny przyjmował konformację krzesłową lub skręconego krzesła. (Ryc. 3). W większości przypadków część pirymidynowa oraz łańcuch węglowodorowy znajdowały się w pozycji ekwatorialnej w stosunku do pierścienia piperazyny.

Ryc. 3. Model farmakoforowy receptora 5-HT1A według Bronowskiej i współpracowników [49].

 

3.2. Modele farmakoforowe wyznaczone metodami 3D QSAR

Oprócz metod analizy konformacyjnej, przy opracowywaniu modeli topograficznych korzysta się również z trójwymiarowej analizy QSAR, np. z metody CoMFA lub programów „Compass” i „Catalyst”. Ostatni z wymienionych jest obecnie najpowszechniej używany do generowania farmakoforów receptora 5-HT1A [11].

Metodę CoMFA po raz pierwszy zastosowała grupa badaczy pod kierunkiem Glennona [50], wykorzystując do tego bazę 50 pochodnych arylopiperazyny. Zostały one zaprojektowane na podstawie rentgenowskiej analizy strukturalnej NAN-190, jednoczesnego agonisty i antagonisty receptora 5-HT1A (Ryc. 4) Wynikiem obliczeń było przedstawienie trójpunktowego modelu topograficznego, w którym uwzględniono pozycje pierścienia aromatycznego, obu atomów azotu piperazyny oraz pierwszego atomu węgla łańcucha alifatycznego.

Van Steen wraz ze współpracownikami tworząc model farmakoforowy wykorzystali dane dotyczące zależności struktura - aktywność oraz wyniki analizy CoMFA dla dwóch grup heterobicyklicznych arylopiperazyn, zawierających różne podstawniki N4-aryloalkilowe i N4-alkilowe [51]. Pod uwagę wzięto jedynie całkowicie rozciągnięte konformacje. Różnice w aktywności związków względem receptora 5-HT1A w 98 % przypisano czynnikom sterycznym. Stwierdzono, że obszar przestrzennie nieuprzywilejowany znajduje się w odległości 3,5 Å od atomu N4 piperazyny, natomiast obszar sterycznie korzystny dla oddziaływań z receptorem w odległości 7,3 Å (Ryc. 5).

Ryc. 4. Modelowe związki wykorzystane w analizie CoMFA przez zespoły Glennona [50] i Testy [52]: (A) NAN-190, oraz Lopez - Rodriguez [53]: (B) arylopiperazynylowe pochodne bicyklohydantoiny.

 

Ryc. 5. Graficzny opis pól sterycznych w modelu farmakoforowym zaproponowanym przez grupę van Steena [51].

 

Grupa Testy poddała analizie szereg ligandów receptora 5-HT1A, należących do pięciu klas związków chemicznych: pochodnych serotoniny, aminotetralin, arylopiperazyn, aryloksypropanoloamin i tetrahydropirydynyloindoli [52]. Autorzy uwzględnili nie tylko standardowe wartości pól sterycznych i elektrostatycznych, ale również potencjał liofilowości (MLP). Za związek modelowy wybrano  zoptymalizowaną strukturę NAN-190 (rozciągnięty łańcuch węglowy, grupa arylowa prostopadła do pierścienia piperazyny). W rezultacie zaproponowany został ogólny model, wspólny dla kilku klas związków, określający regiony różnego typu oddziaływań w obrębie grup farmakoforowych (Ryc. 6).

 

Ryc. 6. Model Testy i współpracowników [52]. Zaznaczono obszary: 1 - wysokiej gęstości elektronowej; 2 - oddziaływań sterycznych; 3 - zawady przestrzennej; 4 - oddziaływań elektrostatycznych i liofilowych; 5 - oddziaływań polarnych; 6 - niskiej gęstości elektronowej.

 

Badając selektywność ligandów wobec receptorów 5-HT1A1 dla szeregu arylopiperazynowych pochodnych bicyklohydantoiny, grupa naukowców skupiona wokół Lopez-Rodriguez ustaliła czteropunktowy model CoMFA [53]. Otrzymana mapa konturowa potwierdzała wcześniejsze ustalenia badaczy dotyczące zależności struktura-aktywność [54]:

·     podstawniki elektroujemne w pozycji orto lub meta pierścienia fenylowego zwiększają powinowactwo do receptora 5-HT1A;

·         podstawniki w pozycji para (p-F i p-NO2) mają wpływ negatywny;

·      obszar zawady przestrzennej zlokalizowany wokół części hydantoinowej odpowiada za niskie powinowactwo wykazywane przez krótkołańcuchowe arylopiperazyny (n = 1, 2).

Do podobnych wniosków doszli ostatnio Weber i współpracownicy [55], stosując metody chemometryczne.

W 2002 roku zespół Orusa doniósł o zastosowaniu programu „Catalyst” dla grupy arylopiperazynylowych pochodnych benzotiofenu, będących antagonistami i częściowymi agonistami receptora 5-HT1A [56]. Ustalono, że za różną wiązalność z receptorem odpowiadają:

·         w przypadku antagonistów: podstawniki arylowe, opisane jako obszary hydrofobowe (HYD) oraz grupa OH pochodnej benzotiofenu, która pełni rolę donora wiązań wodorowych (HBD);

·         w przypadku częściowych agonistów, istotne znaczenie mają grupa arylowa (AR) i akceptor wiązań wodorowych (HBA).

Podana hipoteza ma jednak ograniczone zastosowanie ze względu na niezbyt liczną grupę testowanych pochodnych i brak walidacji na innej grupie związków.

Program „Catalyst” wykorzystał także inny zespół badaczy [57], koncentrując się na selektywności długołańcuchowych arylopiperazyn wobec receptorów 5-HT1A/5-HT7. Zakładając, że ich bioaktywna konformacja przyjmuje postać liniową, farmakofor receptora 5-HT1A ustalono na podstawie struktury NAN-190, w której łańcuch węglowodorowy był w pełni rozciągnięty [11] (Ryc. 7).

 

Ryc. 7. Schematyczna reprezentacja farmakofora receptora 5-HT1A według Raulta i współpracowników [57], z zaznaczeniem struktur ligandów (1) i (2) mapowanych do modelu farmakoforowego. (HBA - akceptor wiązania wodorowego.)

 

4. Ligandy receptora 5-HT2A

Łańcuchowe arylopiperazyny są powszechnie znane jako ligandy receptora 5-HT1A, jednak wiele związków z tej grupy wykazuje równie wysokie powinowactwo do receptorów 5-HT2A (Tabela 2). Podobnie jak w przypadku receptora 5-HT1A, na wiązalność do receptora wpływa długość linkera węglowodorowego oraz rodzaj podstawnika arylowego przy atomie N1 piperazyny.

W związku z tym, że agoniści i antagoniści receptorów serotoninowych 5-HT2 mają zastosowanie w leczeniu schizofrenii, depresji, stanów lękowych, epilepsji oraz zaburzeń łaknienia [44,45,58], trwają poszukiwania nowych selektywnych ligandów receptora 5-HT2A [59,60,61,62].

 

Tabela 2. Ligandy receptora 5-HT2A  z grupy  policyklicznych arylopiperazyn

Związek

Wzór strukturalny

Ki  [nM]

Bibliografia

X

(Trazodon)

78

23

XI

(Arypiprazol)

3,4

41

XII

(Fananseryna,

RP 62203)

0,37

58

XIII

3100

 

59

XIV

2,04

30

XV

36

63

XVI

47

63

XVII

< 5,0

62

XVIII

6,76

62

 

 

4.1. Modele farmakoforowe wyznaczone metodami analizy konformacyjnej

Pierwsze próby ustalenia cech związku odpowiedzialnych za wiązanie z receptorem 5-HT2A, bazujące na strukturze (+)-LSD, zostały podjęte w 1991 roku przez grupy badawcze Glennona i Höltje [11]. Kolejny model opracowali kilka lat później Höltje i współpracownicy [64], skupiając się na związkach działających antagonistycznie, m.in. pochodnych fenylopiperazyny.  Zasugerowano, że obszary wiążące agonistów i antagonistów receptora 5-HT2A pokrywają się. W tym samym czasie Andersen [65] oraz Mokrosz [66] wraz ze współpracownikami niezależnie zaproponowali zbliżone trójpunktowe modele farmakoforowe antagonistów tego receptora. Badania grupy Andersena bazowały m. in. na pochodnych indolu i indanu, natomiast Mokrosz skupił się na analizie konformacyjnej pochodnych 1-(2-pirymidynylo)piperazyny (Ryc. 8).

 

Ryc. 8. Model farmakoforowy receptora 5-HT2A według grupy Mokrosza [66].

 

W roku 2001 [49] przedstawiono model farmakofora receptora 5-HT2A, poddając analizie różne konformacje analogów buspironu. Łańcuch butylowy aktywnych ligandów, podobnie jak w przypadku ligandów receptora 5-HT1A rozpatrywanych przez ten sam zespół, przyjmował głównie postać zgiętą (Ryc. 9).

 

Ryc. 9. Model farmakoforowy receptora 5-HT2A według grupy Bronowskiej [49].

 

4.2. Modele farmakoforowe wyznaczone metodami 3D QSAR

Dotychczas opublikowano niewiele prac opisujących zastosowanie metod 3D QSAR w przewidywaniu modeli farmakoforowych receptora 5-HT2A. Ze względu na zróżnicowaną strukturę chemiczną antagonistów tego receptora, nie opracowano dotychczas uniwersalnego modelu topograficznego [58]. Przedstawiono dwie grupy modeli: czteropunktowy (klasy I) dla ligandów o budowie liniowej oraz trójkątny (klasy II) dla związków, w których środki pierścieni aromatycznych leżą w narożach trójkąta [67,68]. Model klasy I złożony jest z następujących punktów: protonowanego atomu azotu (PI), akceptora wiązania wodorowego (HBA) oraz dwóch miejsc oddziaływań hydrofobowych aromatycznych (HYA). Tę klasę reprezentuje spiperon, antagonista receptora D2 (Ki=0,1 nM) i 5-HT2A (Ki=1 nM). W modelach II klasy, dla których wzorcem jest mianseryna, istotne dla wiązania z receptorem są jedynie trzy obszary: protonowanego atomu azotu (PI), oddziaływań hydrofobowych (HY) i pierścienia aromatycznego (RA) (Ryc. 10). Opisane modele są zgodne z wcześniejszymi założeniami innych badaczy [64].

 

Ryc. 10. Modele farmakoforowe receptora 5-HT2A [67,68]: (A) czteropunktowy (wyznaczony na podstawie struktury spiperonu); (B) trójpunktowy (dla mianseryny). Opisano obszary: PI - protonowanego atomu azotu, HBA - akceptorów wiązania wodorowego, HY - oddziaływań hydrofobowych, HYA - oddziaływań hydrofobowych aromatycznych, RA - pierścienia aromatycznego.

Z danych literaturowych wynika, że powinowactwo do receptora 5-HT2A jest najsilniejsze dla związków zawierających łańcuch propoksylowy lub propylowy [30,63]. Na zwiększenie powinowactwa wpływa także rodzaj podstawnika przy pierścieniu aromatycznym - najkorzystniejsze wartości Ki uzyskano dla podstawników m-CF3, m-Cl, o-OCH3 i naftylowego [30, 63, 69].

5. Ligandy receptora 5-HT7

Z danych literaturowych wynika, że związki zawierające szkielet arylopiperazyny, które wykazują wysokie powinowactwo do receptora 5-HT7, są często ligandami innych receptorów serotoninowych (5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2C) a także receptora α1-adrenergicznego i dopaminergicznego D2 [32,37,70,71]. Jest to spowodowane bliskim podobieństwem struktury miejsc wiążących receptorów związanych z białkiem G. Stwierdzono, że receptory z grupy 5-HT7 są związane z różnorodnymi schorzeniami ośrodkowego układu nerwowego, takimi jak schizofrenia, depresja, epilepsja, migrena, a także zaburzenia pracy serca [72,73]. W ostatnich latach ukazało się kilkanaście prac dotyczących badań nad nowymi, selektywnymi ligandami tego receptora [32,35,70,71,74-78] (Tabela 3).

Tabela 3. Ligandy receptora 5-HT7  z grupy policyklicznych arylopiperazyn

Związek

Wzór strukturalny

Ki [nM]

Bibliografia

XIX

(Tiospiron)

 

9,2

79

XX

(WAY-100635)

 

6,8

80

XXI

0,38

78

XXII

1,4

79

XXIII

8,3

75

XXIV

 

36

32

XXV

6,0

79

XXVI

6,6

75

XXVII

7,94

81

 

 

5.1. Modele farmakoforowe wyznaczone metodami 3D QSAR

Pierwszą hipotezę dotyczącą oddziaływania ligandów z receptorem serotoninowym 5-HT7 wysunęła w 2000 roku grupa naukowców skupiona wokół Lopez-Rodriguez [75]. Korzystając z oprogramowania „Catalyst”, autorzy analizowali szereg dostępnych w literaturze antagonistów (Ryc. 11A). Po optymalizacji ustalono [76], że dla związania z receptorem niezbędna jest obecność pięciu elementów strukturalnych: dodatnio naładowanego atomu azotu (PI), trzech obszarów hydrofobowych  (HYD) oraz grupy będącej akceptorem wiązań wodorowych (HBA) (Ryc. 12A). Zaobserwowano, że w przypadku antagonistów:

·         optymalna długość łańcucha węglowego wynosi 4 lub 5 jednostek;

·         protonowany atom N4 piperazyny odgrywa znaczącą rolę w wiązaniu z receptorem, oddziałując z nim elektrostatycznie;

·         hydrofobowy region HYD3 musi mieć charakter aromatyczny.

Ryc. 11. Przykładowe N-podstawione arylopiperazyny mapowane przez zespoły Lopez-Rodriguez [76] (A) oraz Vermeulena [80] (B) do modeli farmakoforowych receptora 5-HT7, w celu wyznaczenia korelacji struktura-aktywność.

 

Intensywne badania CoMFA nad topografią receptora 5-HT7 podjęli również Vermeulen i współpracownicy [74,80]. Przedstawiony przez nich model agonisty określał odległości między dwoma obszarami oddziaływań hydrofobowych (płaskich pierścieni aromatycznych), regionem dodatnio naładowanym a miejscem wiązania wodorowego, którego akceptorem jest atom tlenu grupy karbonylowej (Ryc. 12B).

 

Ryc. 12. Schematy modeli farmakoforowych receptora 5-HT7 dla: (A) agonisty według Lopez- Rodriguez [76] i (B) antagonisty zaproponowany przez Vermeulena i współ.[80].

 

5.2. Modele farmakoforowe wyznaczone na podstawie struktury receptora

Wkładem polskich naukowców w badania nad farmakoforem receptora 5-HT7 są ostatnio opublikowane modele oparte na wynikach dokowania aktywnych ligandów [81]. Autorzy przedstawili dwie hipotezy antagonistycznego wiązania z receptorem: jedną dotyczącą ogólnych cech powinowactwa do receptora, drugą - opisującą warunki selektywności ligandu (Ryc. 13). Warunkiem wystąpienia powinowactwa jest obecność przynajmniej trzech z sześciu następujących cech strukturalnych: atomu azotu w postaci sprotonowanej (PI), trzech obszarów hydrofobowych/aromatycznych (HYD/AR1–3) oraz dwóch ugrupowań będących akceptorami wiązania wodorowego (HBA1,2). Natomiast selektywność jest wynikiem wystąpienia silnych oddziaływań elektrostatycznych (PI) i π – elektronowych (AR1), wspólnych dla wszystkich selektywnych antagonistów, oraz dodatkowo jednego z trzech wiązań: HBA1 albo HYD/AR2.

 

Ryc. 13. Modele farmakoforowe receptora 5-HT7: (A) hipotetyczny model „aktywności” ligandów; (B) hipotetyczny model „selektywności” ligandów; (C) struktura jednego z nieselektywnych antagonistów [81].

 

6. Wnioski

Techniki komputerowe znacznie podnoszą efektywność poszukiwania nowych substancji leczniczych, są to jednak metody wciąż rozwijane i obarczone ograniczeniami. Wynika to zarówno z uproszczeń algorytmów obliczeniowych, jak i z faktu, że receptor może posiadać więcej niż jedno miejsce aktywne, może też być akceptorem kilku różnych ligandów czy też dla jednego centrum aktywności możliwych jest kilka grup farmakoforowych. Ponadto programy komputerowe wykonują obliczenia dla stanu podstawowego, który podczas wiązania z receptorem może ulec wzbudzeniu [1].

 

7. Wykaz symboli i skrótów

AAA

metoda przybliżenia aktywnego analogu

(ang. Active Analog Approach)

AR, Ar

grupa aromatyczna

CoMFA

porównawcza analiza pól cząsteczkowych

(ang. Comparative Molecular Field Analysis)

CoMSIA

porównawcza analiza wskaźników cząsteczkowego podobieństwa

(ang. Comparative Molecular Similarity Index Analysis)

3D QSAR

trójwymiarowa analiza QSAR

EC50

efektywne stężenie u 50% badanych osobników

(ang. Effective Concentration)

ED50

dawka efektywna dla 50% badanych osobników

(ang. Effective Dose)

HBA

akceptor wiązania wodorowego (ang. Hydrogen Bond Acceptor)

HBD

donor wiązania wodorowego (ang. Hydrogen Bond Donor)

5-HT

5-hydroksytryptamina; serotonina; receptor serotoninowy

HYA, HYD, HY

grupy hydrofobowe (aromatyczne lub alifatyczne)

IC50

połowa maksymalnego stężenia hamującego

(ang. Inhibitory Concentration)

IUPAC

Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej)

(ang. International Union of Pure and Applied Chemistry)

Ki (Ki50)

stała inhibicji (ang. Inhibitor Constant)

Km

stała Michaelisa (ang. Michaelis Constant)

LogD7,4 

wartość logP wyznaczona w roztworze o pH=7,4

LogP

współczynnik podziału oktanol/woda; lipofilowość

LogS

rozpuszczalność w wodzie

MLP

potencjał liofilowości (ang. Molecular Lipophilicity Potential)

MR

refraktywność molowa (ang. Molar Refractivity)

PI

grupa zdolna do dodatniej jonizacji (zasadowy atom azotu)

QSAR

ilościowa zależność między strukturą związku a jego aktywnością

(ang. Quantitative Structure – Activity Relationship)

QSPR

ilościowa zależność między strukturą związku a jego właściwościami

(ang. Quantitative Structure – Property Relationship)

 

8. Bibliografia

  1.       Kapetanovic I.M., Chem. Biol. Interact. 2008, 171, 165

  2.       Oprea T.I., Molecules 2002, 7, 51

  3.       Tetko I.V., Mini Rev. Med. Chem. 2003, 3, 809

  4.       Veselovsky A.V., Ivanov A.S., Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2003, 3, 33

  5.       Ekins S., Mestres J., Testa B., Br. J. Pharm. 2007, 152, 21

  6.       Guner O. F., Curr. Top. Med. Chem.  2002,  2, 1321

  7.       Sylte I., Bronowska A., Dahl S.G., Europ. J. Pharm., 2001, 416, 33

  8.       Ooms F., Curr. Med. Chem. 2000,7, 141

  9.       Schneidman-Duhovny D., Nussinov R., Wolfson H.J., Curr. Med. Chem. 2004,11, 91

 10.      Wermuth C.G., Ganellin C.R., Lindbergh P.,  Mitscher A., Pure Appl. Chem., 1998, 70, 1129

 11.      Bojarski A., Curr. Top. Med. Chem., 2006, 6, 2005

 12.      http://www.chem.uw.edu.pl/studia/w_mono_sf/

 13.      Hibert M.F., McDermott I., Middlemiss D.N., Mir A.K., Fozard J.R. , Eur. J. Med. Chem. 1989, 24, 31

 14.      Silverman R.B., Chemia organiczna w projektowaniu leków, WNT, Warszawa, 2007

 15.      Patrick G.L., Chemia medyczna. Podstawowe zagadnienia, WNT, Warszawa, 2003

 16.      Tetko I.V., Tanchuk V.Y., Kasheva T.N., Villa A.E., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2001, 41, 246

 17.      Maciejewska D., Zołek T., Herold F., J. Mol. Graph. Model., 2006, 25, 353

 18.      Tripos Bookshelf – materiały informacyjne firmy Tripos; www.tripos.com

 19.      Kim K. H., Greco G. Novellino E., Persp. Drug Disc. Des., 1998, 12, 257

 20.      Efremov R.G., Chugunov A.O., Pyrkov T.V., Priestle J.P., Arseniev A.S., Jacoby E., Curr. Med. Chem., 2007, 14, 393

 21.      Kubinyi H., Encyclopedia of Computational Chemistry, John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, UK, 1998

 22.      http://www.icm.edu.pl/kdm/Projektowanie_lek%C3%B3w

 23.      Oh J.S., Ha H.-J., Chi D.Y., Lee H.K., Curr. Med. Chem. 2001, 8, 999

 24.      López-Rodríguez M.L., Ayala D., Benhamú B., Morcillo M.J., Viso A., Curr. Med. Chem. 2002, 9, 443

 25.      Pessoa-Mahana H., Araya-Maturana R., Saitz C.B., Pessoa-Mahana D.C. Mini Rev.Med. Chem. 2003, 3,77

 26.      Caliendo G., Santagada V., Perissutti E., Fiorino F., Curr Med. Chem. 2005, 12, 1721

 27.      Kowalski P., Kowalska T., Mokrosz M.J., Bojarski A.J., Charakchieva-Minol S., Molecules 2001, 6, 784

 28.      Tandon M., O’Donnell M.M., Porte A., Vensel D., Yang D., Palma R., Beresford A., Ashwell M.A., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 1709

 29.      Kołaczkowski M., Zajdel P., Fhid O., Duszyńska B., Tatarczyńska E., Pawłowski M., Pharmacol. Rep., 2005, 57, 229

 30.      Tomić M., Ignjatović D., Tovilović G., Andić D., Roglić G., Kostić-Rajačić S., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007, 17, 5749

 31.      Bojarski A.J., Kuran B., Kossakowski J., Kozioł A., Jagiełło-Wójtowicz E., Chodkowska A., Eur. J. Med. Chem. 2009, 44, 152

 32.      Bojarski A. J., Duszyńska B., Kołaczkowski  M., Kowalski, P., Kowalska T., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 5863

 33.      Penjišević J., Šukalović V., Andrić D., Kostić-Rajačič S., Šoškić V., Roglić G., Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2007, 340, 456

 34.      Mattson R.J., Catt J.D., Sloan Ch.P., Gao Q., Carter R.B., Gentile A., Mahle C.D., Matos F.F., McGovern R., Vander-Maelen C.P., Yocca F.D., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 285

 35.      Bojarski A.J., Paluchowska M., Duszyńska B., Kłodzińska A., Tatarczyńska E., Chojnacka-Wójcik E., Biorg. Med. Chem. 2005, 13, 2293

 36.      Paluchowska M., Bugno R., Charakchieva-Minol S., Bojarski A.J., Tatarczyńska E., Chojnacka-Wójcik E., Arch. Pharm. Life Sci. 2006, 339, 498

 37.      Bojarski A.J., Paluchowska M.H., Duszyńska B., Bugno R., Kłodzińska A., Tatarczyńska E., Chojnacka-Wójcik E., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1391

 38.      Lopez-Rodriguez M.L., Morcill M.J., Fernandez E., Porras E., Orensanz L., Beneytez M.E., Manzanares J., Fuentes J.A., J. Med. Chem. 2001, 44, 186

 39.      Goldbech O.A, Dahl O., Peter N.E., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 12, 1551

 40.      Lopez-Rodriguez M.L., Ayala D., Viso A., Benhamu B., De la Pradilla R.F., Zarzaa F., Ramos J.A., Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 1551

 41.      Stark A., Jordan S., Allers K.A., Bertekap R.L., Chen R., Kannan T.M., Molski T.F., Yocca F.D., Sharp T., Kikuchi T., Burris K.D., Psychopharmacology 2007, 190, 373

 42.      Zlatović M.V., Šukalivić V.V., Kostić-Rajačić S., Andić D.B, Roglić GM, J. Serb. Chem. Soc., 2006, 71, 1125

 43.      Andić D., Tovilović G., Roglić G., Šoškić V., Tomić M., Kostić-Rajačić S., J. Serb. Chem. Soc., 2007, 72, 747

 44.      Jones B.J., Blackburn T.P., Pharm. Biochem. Behav. 2002, 71, 555

 45.      Hoyer D., Hannon J.P., Martin G.R., Pharm. Biochem. Behav. 2002, 71, 533

 46.      Hibert M. F., Gittos M. W., Middlemiss D. N., Mir A. K., Fozard J. R.,  J. Med. Chem. 1988, 31, 1087

 47.      Mokrosz M. J., Duszynska B., Bojarski A. J., Mokrosz J. L., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 533

 48.      Chilmonczyk Z., Szelejewska-Wozniakowska A., Cybulski J., Cybulski M., Kozioł A. E., Gdaniec M., Arch. Pharm.(Weinheim) 1997, 330, 146

 49.      Bronowska A., Leś A., Chilmonczyk Z., Filipek S.,  Edvardsen Ø.,  Østensen R.,  Bioorg. Med. Chem. 2001, 9, 881

 50.      Glennon, R.A., Drug Dev. Res. 1992, 26, 251

 51.      Van Steen B. J., van Wijngaarden I., Tulp M. T., Soudijn W., J. Med. Chem. 1994, 37, 2761

 52.      Gaillard P., Carrupt P. A., Testa B., Schambel P., J. Med. Chem. 1996, 39, 126

 53.      Lopez-Rodriguez, M. L., Rosado M. L., Benhamu B., Morcillo M. J., Fernandez  E., Schaper K. J., J. Med. Chem. 1997, 40, 1648

 54.      Rodriguez, M. L., Rosado M. L., Benhamu B., Morcillo M. J., Sanz  A. M., Orensanz L., Beneitez  M. E.,  Fuentes J. A., Manzanares J.,  J. Med. Chem. 1996, 39, 4439

 55.      Weber K.C., da Silva A.B.F., Eur. J. Med. Chem. 2008, 43, 364

 56.      Orus L., Perez-Silanes S., Oficialdegui A. M., Martinez-Esparza J., Del Castillo J. C., Mourelle M., Langer T., Guccione S., Donzella G., Krovat E. M., Poptodorov K., Lasheras B., Ballaz S., Hervias I., Tordera R., Del Rio J., Monge A., J. Med. Chem. 2002, 45, 4128

 57.      Lepailleur A., Bureau R., Paillet-Loilier M., Fabis F., Saettel N., Lemaitre S., Dauphin F., Lesnard A., Lancelot J. C., Rault S., J. Chem. Inf. Model. 2005, 45, 1075

 58.      Westkaemper R. B., Glennon R. A., Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2, 575

 59.      Gonzalez-Gomez J.C., Santana L., Uriarte E., Brea J., Villazon M., Loza M.I., De Luca M., Rivas M.E., Montenegro G.Y., Fontenla J.A., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 175

 60.      Zajdel P., Subra G., Bojarski A.J., Duszyńska B., Tatarczyńska E., Nikiforuk A., Chojnacka-Wójcik E., Pawłowski M., Martinez J., Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 2907

 61.      Paluchowska M.H., Bugno R., Bojarski A.J., Charakchieva-Minol S., Duszyńska B., Tatarczyńska E., Kłodzińska A., Stachowicz K., Chojnacka-Wójcik E., Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 1195

 62.      Brea J., Rodrigo J., Carrieri A., Sanz F., Cadavid M.I., Enguix M.J., Villazón M., Mengod G., Yolanda Caro, Masaguer Ch.F., Raviña E., Centeno N.B., Carotti A., Loza M.I., J. Med. Chem. 2002, 45, 54

 63.      Obniska J., Kołaczkowski M., Bojarski A.J., Duszyńska B, Eur. J. Med. Chem. 2006, 11, 874

 64.      Holtje H. D., Jendretzki U. K., Pharm. Pharmacol. Lett. 1992, 1, 89

 65.      Andersen K., Liljefors T., Gundertofte K., Perregaard J., Bogeso K. P., J. Med. Chem. 1994, 37, 950

 66.      Mokrosz J. L., Strekowski L., Duszyńska B., Harden D. B., Mokrosz M. J., Bojarski A. J., Pharmazie 1994, 49, 801

 67.      Rowley M., Bristow  L. J.,  Hutson P. H., J. Med. Chem. 2001, 44, 477

 68.      Klabunde T., Evers A., Chembiochem. 2005, 6, 876

 69.      Obniska J., Kołaczkowski M., Charakchieva-Minol S., Nędza K., Dybała M., Bojarski A.J., Pharmacol. Rep., 2005, 57, 336

 70.      Yong H. N., Sung H. H., Jung H. L., Woo-Kyu P., Du-Jong B.,,Hun Y. K., Yong S. Ch., Hyunah Ch., Ae N. P., Bioorg. Med. Chem., 2008, 16, 2570

 71.      Juhee Y., Eun A. Y., Ji-Yeon K., Ae N. P., Hyewhon R., Woo-Kyu P., Yang K.J., Hea-Young P.Ch., Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 5405

 72.      Mnie-Filali O., Lambás-Señas L., Zimmer L., Haddjeri N., Drug News Perspect. 2007, 20, 613

 73.      Pittalà V., Salerno L., Modica M., Siracusa M.A., Romeo G., Mini Rev. Med. Chem. 2007, 7, 945

 74.      Vermeulen E. S., Schmidt A. W., Sprouse J. S., Wikstrom H. V., Grol C. J., J. Med. Chem. 2003, 46, 5365

 75.      Lopez-Rodriguez M. L.; Porras, E.; Benhamu, B.; Ramos, J. A.; Morcillo, M. J.; Lavandera, J. L. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 1097

 76.      Lopez-Rodriguez M. L., Porras E., Morcillo M. J., Benhamu B., Soto L. J., Lavandera J. L., Ramos J. A., Olivella M., Campillo M., Pardo L., J. Med. Chem. 2003, 46, 5638

 77.      Hagan J.J., Price G.W., Jeffrey P., Deeks N.J., Stean T., Piper D., Smith M.I., Upton N. Medhurst A.D., Middlemiss D.N., Riley G.J., Lovell P.J., Bromidge S.M., Thomas D.R., Br. J. Pharmacol. 2000, 130, 539

 78.      Volk B., Barkóczy J., Hegedus E., Udvari S., Gacsályi I., Mezei T., Pallagi K., Kompagne H., Lévay G., Egyed A., Hársing L.G. Jr, Spedding M., Simig G., J. Med. Chem. 2008, 51, 2522

 79.      Leopoldo M., Curr. Med. Chem. 2004, 11, 629

 80.      Vermeulen E. S., van Smeden M., Schmidt A. W., Sprouse  J. S., Wikstrom H. V., Grol C. J., J. Med. Chem. 2004, 47, 5451

 81.      Kołaczkowski M., Nowak M., Pawłowski M., Bojarski A.J. J. Med. Chem. 2006, 49, 6732